【求助】请教RhoA检测的几种方法
丁香园论坛
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看了文献测活性RhoA 有几种方法：
1、经典的，是放射标记γ32-P-GTP 方法，因为放射性，现在不怎么用了。
2、看到国内有文献，采用分离胞膜胞浆，然后用抗RhoA抗体做western。这是基于胞浆都是GDP-RhoA，胞膜是GTP-RhoA的原理，但是总觉得有什么不对的地方？为什么没有被广泛采用？
3、现在多采用 pull down方法，RhoA-GTP与Rhotekin的RBD结合，最后用RhoA抗体检测沉淀物中RhoA-GTP含量。试剂盒是upstate及cytoskeleton公司都有。但是区别upstate测的是活性Rho，而细胞骨架公司的测的是活化的RhoA。看了说明书，操作中要液氮，要低温，要保持RhoA的活性不被降解，而且试剂盒贵，1万元左右。
4、看了还有G-LISA的方法，用抗体与活化的RHOA结合的原理。用的是抗GTP-RhoA。
有人做过相关的检测吗？这几种方法有缺点，或者说更科学合理的道理在何处？求解，谢谢
1、经典的，是放射标记γ32-P-GTP 方法，因为放射性，现在不怎么用了。
2、看到国内有文献，采用分离胞膜胞浆，然后用抗RhoA抗体做western。这是基于胞浆都是GDP-RhoA，胞膜是GTP-RhoA的原理，但是总觉得有什么不对的地方？为什么没有被广泛采用？
3、现在多采用 pull down方法，RhoA-GTP与Rhotekin的RBD结合，最后用RhoA抗体检测沉淀物中RhoA-GTP含量。试剂盒是upstate及cytoskeleton公司都有。但是区别upstate测的是活性Rho，而细胞骨架公司的测的是活化的RhoA。看了说明书，操作中要液氮，要低温，要保持RhoA的活性不被降解，而且试剂盒贵，1万元左右。
4、看了还有G-LISA的方法，用抗体与活化的RHOA结合的原理。用的是抗GTP-RhoA。
有人做过相关的检测吗？这几种方法有缺点，或者说更科学合理的道理在何处？求解，谢谢
您好！您是否找到相关方法了？正做这个呢，所以很想请教，谢谢啊！要是您找到了可否发到我邮箱呢
园子不允许留邮箱，请通过站内信沟通，谢谢合作。
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还有个疑问，那就是Neweast 和cytoskeleton都是RhoA试剂盒，前者说明书讲细胞检测前需长到80-90%，后者说明书讲，细胞融合度大于80%就别测RhoA的活性了，细胞反应不好的（我自己语言，就那个意思），这不是矛盾吗？
2个试剂盒还有不同点：
裂解液的成分不一样，前者有triton X，后者没有，前者说裂解时间是10-20分钟，后者说要控制裂解时间不超过10min，否则GTP-RhoA水解就会发生。前者裂解液会变粘，后者不会。
裂解液的成分不一样，前者有triton X，后者没有，前者说裂解时间是10-20分钟，后者说要控制裂解时间不超过10min，否则GTP-RhoA水解就会发生。前者裂解液会变粘，后者不会。
目标杂志，目标杂志上用什么方法我就用什么方法
阿兰梦 wrote:
看了文献测活性RhoA 有几种方法：
1、经典的，是放射标记γ32-P-GTP 方法，因为放射性，现在不怎么用了。
2、看到国内有文献，采用分离胞膜胞浆，然后用抗RhoA抗体做western。这是基于胞浆都是GDP-RhoA，胞膜是GTP-RhoA的原理，但是总觉得有什么不对的地方？为什么没有被广泛采用？
3、现在多采用 pull down方法，RhoA-GTP与Rhotekin的RBD结合，最后用RhoA抗体检测沉淀物中RhoA-GTP含量。试剂盒是upstate及cytoskeleton公司都有。但是区别upstate测的是活性Rho，而细胞骨架公司的测的是活化的RhoA。看了说明书，操作中要液氮，要低温，要保持RhoA的活性不被降解，而且试剂盒贵，1万元左右。
4、看了还有G-LISA的方法，用抗体与活化的RHOA结合的原理。用的是抗GTP-RhoA。
有人做过相关的检测吗？这几种方法有缺点，或者说更科学合理的道理在何处？求解，谢谢
pull down，cytoskeleton
我正准备做，不知道您最后用pull down，cytoskeleton的做的怎么样了，难度在哪里，群里还有没有战友可以交流，急
upstate及cytoskeleton是杂志中用得比较多的，我用的后者，是包括裂解液，蛋白酶抑制剂等等很全的一个试剂盒，说明书20多页。很详细，注意事项都说到了。按照它的protocol做，效果很好，也附有各种差错现象分析，实在不行还可以写电邮给产家，有个老外会给你很详细的答复和建议的。
请问动物组织标本可以做吗
lljt wrote:
请问动物组织标本可以做吗
可以的，大鼠脑组织也可以做的
[img]file:///C:/Documents%20and%20Settings/new/Application%20Data/Tencent/Users/386936271/QQ/WinTemp/RichOle/8AUEYQFL3B6VD~$~5Z%7BPL%7BY.jpg[/img] 不知道对于标本的保存有没有特殊要求。是不是要求新鲜的组织，多久时间内的组织可以
××××。楼主好，我也要做rho家族的蛋白活化，您可以给点建议
版主dachong99留言:
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我也想做啊~~~加个qq呗~~~谢谢！！！××××
版主dachong99留言:
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lxxlovegsj wrote:
我也想做啊~~~加个qq呗~~~谢谢！！！×××
楼主，您好，我现在要做过表达RhoA，后续要测RhoA及ROCK的活性，看了很多文献没有找到明确的方法，看到楼主您的帖子很开心，您能针对检测RhoA的活性给晚辈一些建议吗？另外，您说的这个“活性RhoA”和“活化的RhoA”有什么区别吗？希望得到您的回复，不胜感激！
您好，不知您可否方便把Cytokeleton 的裂解液，蛋白酶抑制剂等等试剂盒的说明书给我发送一份，我的邮箱是×××
版主dachong99留言:
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当爱已成往事。。。。我早就毕业，洗手不干了。不过原来的资料还收着，贴出来大家琢磨琢磨。
分别是三家公司的说明书
分别是三家公司的说明书
meixiacao wrote:
楼主，您好，我现在要做过表达RhoA，后续要测RhoA及ROCK的活性，看了很多文献没有找到明确的方法，看到楼主您的帖子很开心，您能针对检测RhoA的活性给晚辈一些建议吗？另外，您说的这个“活性RhoA”和“活化的RhoA”有什么区别吗？希望得到您的回复，不胜感激！
你看错了，我说的是Rho和RhoA，这2个是不同的概念
太感谢楼主了，祝您工作顺利，天天好心情
楼主您好，我想请问pull down，cytoskeleton的试剂盒除了可以检测RhoA的活性外,它的下游分子ROCK的用这个试剂盒可以检测吗？还是需要另外在购买试剂盒？我才接触打算检测RhoA和ROCK的活性，以及其蛋白表达，但是全都是一头雾水，希望能得到前辈的指点。万分感谢
可以用G-lisa吧，不过好像G-LISA只能测得活化的rho，总的rho测不出来
lyzerd
可以用G-lisa吧，不过好像G-LISA只能测得活化的rho，总的rho测不出来
谢谢您，我已经购买了试剂盒，非常感谢您的回复，有问题会继续请教前辈的。
我也要做这个实验，想请教一下测活性时的细胞密度应该是多少？我的是人脐静脉内皮细胞，不知有没有战友做过，请指教？谢谢！
我最近也在为怎么测Rho的活性犯愁了呢。细胞实验做过几次Rhotekin－pull down失败了，可能是rhotekin蛋白质量不高，可能是buffer不好，可能。。。现在还想做，最近准备找一些下游的磷酸化基质用磷酸化抗体做WB去模拟Rho的活性，不知道大家有没有好的Rho的下游的磷酸化抗体 推荐一下啊。初次求助，请赐教哇！！！
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