常见的几种方法

实验试剂准备详见「其他」。

1. 胰酶消化单层培养的细胞，用适当的完全培养基悬浮细胞。

1.1 对 XGPRT 筛选、噬斑选择或颜色筛选，用 BS-C-1 细胞。

1.2 对 TK 筛选，用 HuTK-143B 细胞。

1.3 对于 MVA，用 BHK-21 或 CEF 细胞。

2. 用血球计数器对细胞计数（附录 3F）。

3. 按 5 ×10⁵ 细胞/孔将细胞加到 6 孔培养板中（最终 2 ml/孔），培养生长至汇片（所需时间少于 24 h）。

4. 按以下方法制备细胞。

4.1 对于 XDPRRT 筛选，在含 1/400 体积 10 mg/ml MPA、1/40 体积 10 mg/ml 黄嘌呤和 1/670 体积 10 mg/ml 次黄嘌呤且经过滤除菌的完全 MEM-2.5 培养基中， 预培养 12～24 h。

4.2 对于噬斑或 TK 选择或颜色筛选的方法，则不需要预培养。

5. 使用前将 100 μl 的转染细胞溶解产物和 100 μl 的 0.25 mg/ml 的胰酶混合，涡旋混 匀。在 37℃ 水浴中温育 30 min，温育过程中每隔 5～10 min 涡旋一次，然后在冰上超声 20～30 s。对于 MVA，可以不用消化，但要超声 20～30 s 以打散结团。

6. 在 MEM-2.5 完全培养基中对胰酶消化和（或）超声处理的细胞溶解产物进行 4 次 10 倍的系列稀释 （稀释范围为 10^-2~10^-4）：

6.1 对于 XGPRT 筛选，按步骤 4.1 所述的浓度加入 MPA、黄嘌呤和次黄嘌呤。

6.2 对于噬斑或 TK 选择或颜色筛选的方法，则不需要加。

7. 将培养单层细胞的培养基吸出（来自步骤 3），用每孔 1 ml 稀释溶解物的剂量去感染细胞（10-2～10—4）。培养 2 h，每隔 30 min 摇动一次。

8. 在 2 h 感染完成之前，溶解适当体积的 2％ LMP 琼脂糖（1.5 ml × 孔的数量），在 45℃ 水浴中冷却（在用琼脂糖覆盖细胞之前保证它确实已经冷却到 45℃）。将以下 物质加入到 2 × 完全噬斑培养基-5 以制备所需的适当数量的噬斑选择培养基 （1.5 ml × 孔的数量），并加热到 45℃。

8.1 对于 XGPRT 筛选，按步骤 4.1 所述浓度的两倍加入 MPA、黄嘌呤和次黄嘌呤。 两倍浓度是必需的，因为 2 × 完全噬斑培养基-5 将和琼脂糖按 1 : 1 的比例混合。

8.2 对于 TK 筛选，加入 1/100 体积的 5 mg/ml BrdU。

8.3 对于噬斑或颜色筛选的方法，则不需要加。

9. 通过等体积混合 2％ 的 LMP 琼脂糖和步骤 8.1 或 8.2 制备的噬斑选择培养基制备适当的选择琼脂糖。

10. 将接种的病毒溶液从被感染的细胞中吸出（来自步骤 7），用 3 ml 适当的选择琼脂糖覆盖细胞，在室温或 4℃ 让琼脂糖凝固。培养 2 天。

11. 通过等体积混合 2％ 的 LMP 琼脂糖（1 ml × 孔的数量，按步骤 8 融解并冷却至 45℃） 和含 1/100 体积 10 mg/ml 的中性红的 2 × 完全噬斑培养基-5 （每孔 1 ml， 加热至 45℃） 制备第二层覆盖琼脂糖。如果使用 β-半乳糖筛选，则要向琼脂糖/噬斑培养基中加入 1/120 体积的 4％ X-gal。如果使用 GUS 筛选，则加入 1/100 体积 的 2％ 的 X-gluc。用 2 ml 的这种第二层覆盖琼脂糖覆盖每孔细胞，让其凝固，过夜培养。

12. 向无菌离心管中加入 0.5 ml MEM-2.5 完全培养基。当温育周期结束后，用一无菌有棉花滤芯的巴斯德吸管伸入到琼脂糖中挑取分离较好的噬斑。刮下单层细胞，将琼脂糖块吸入吸管中，转移到含有 0.5 ml MEM-2.5 完全培养基的管中。用新的吸 管重复挑选 6～12 个噬斑放于不同的小管中。

13. 涡旋每个含病毒的小管，用反复冻融的方法裂解小管中的病毒：用干冰/乙醇冻结， 37℃ 水浴、涡旋解冻。如此进行 3 次。

14. 将其置于冰水上，在杯状超声仪上以最大功率超声 20～30 s。如果只是用 TK 进行筛选，则应用 PCR 方法、DNA 点杂交或免疫染色进行验证分离的噬斑，因为有些噬斑含有自发的 TK^- 突变而不是重组病毒。

15. 按照步骤 1～4 所述的方法制备适当的贴壁培养的单层细胞。每个噬斑的分离需要一块 6 孔板。

16. 对每个分离的噬斑做 10^-1、10^-2、10^-3 3 个 10 倍系列稀释（步骤 6）。

如果用 XGPRT 进行筛选，则需要用筛选药物进行预培养，做系列稀释时也应含有筛选药物（步骤 4）。

17. 吸出培养基，用 1 ml 病毒稀释液感染细胞，每个稀释度感染两孔。培养 2 h，每隔 30 min 用手轻轻摇晃一次。

18. 重复步骤 8～14 的操作，进行三轮或更多轮的噬斑纯化，确保得到单克隆的纯化重组病毒。

试剂：

完全MEM-2.5培养基

筛选试剂（对于 XGPRT 筛选；抽滤除菌，-20℃ 保存）：

10 mg/ml （400 ×）麦考酚酸（MPA； Calblochem），溶于 0. 1 mol/L NaOH；

10 mg/ml （40 ×）黄嘌呤，溶于 0. 1 mol/L NaOH；

10 mg/ml （670 ×）次黄嘌呤，溶于 0.1 mol/L NaOH

2％ 的 LMP 琼脂糖（LifeTechnologies）水溶液，高压灭菌

完全 2 × 噬斑培养基-5

5 mg/ml 5-溴脱氧尿苷（BrdU），溶于水（用于 TK 筛选；过滤除菌，-20℃ 保存）

10 mg/ml 中性红溶液，溶于水

4％ X-gal 溶液，溶于二甲基甲酰胺（可选，用于半乳糖苷酶筛选；）

2％ X-gluc 溶液，溶于二甲基甲酰胺（可选，用于 GUS 筛选）

干冰/乙醇