做细胞凋亡检测实验的方法？和具体要求？

细胞凋亡的检测方法也有许多种：

一、磷脂酰丝氨酸外翻

正常情况下，磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）主要分布在细胞膜内侧，即与细胞浆相邻的一侧。在细胞发生凋亡的早期，不同类型的细胞都会出现磷脂酰丝氨酸外翻的现象。Annexin V 是一类广泛分布于真核细胞细胞浆内的 Ca2+依赖型磷脂结合蛋白，参与细胞内的信号转导，能与 PS 特异性结合，且具有较高亲和力。用特定荧光探针标记 Annexin V，就可以利用流式细胞仪或荧光显微镜简单直接地检测 PS 外翻这一细胞凋亡重要特征。

二、线粒体跨膜电位改变

细胞发生凋亡时，线粒体通透性转换孔的开放显著改变了线粒体通透性。持续的线粒体通透性转换孔开放，导致 Ca2+过载、线粒体氧化型谷胱甘肽、线粒体中活性氧水平升高，最终导致细胞色素 C 的释放及线粒体膜电位降低和消失。

利用特定的阳离子荧光染料对线粒体膜电位变化进行测定。正常情况下，线粒体内部存在大量的负电荷，阳离子荧光染料会在线粒体基质中积聚，当细胞发生凋亡时，线粒体膜电位丢失，线粒体通透性转换孔持续开发，荧光染料被释放到细胞质中，线粒体内荧光强度明显下降。可以利用荧光显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪等设备通过荧光信号的强弱来判断线粒体膜电位变化和细胞凋亡情况。

三、Caspase 活性检测

称为胱天蛋白酶或半胱天冬酶，是一组存在于胞质溶胶中的半胱氨酸蛋白酶。能够特异性切割含有天冬氨酸（Asp）的多肽底物，选择性地对多种信号转导途径中的蛋白质进行高效切割，在介导细胞凋亡过程中起重要作用，并参与细胞的炎症、生长和分化等过程。

四、DNA 断裂

细胞发生凋亡时，细胞内特异性核酸内切酶活化，染色质 DNA 在核小体间被特异性切割，DNA 降解成 180--200bp 或其整数倍片段，因此凋亡细胞中提取的 DNA 在进行常规的琼脂糖凝胶电泳时，这些大小不同的 DNA 片段就呈现出梯形条带（DNA ladders），这一方法是鉴定细胞凋亡最为简单可靠的方法之一。

流式检测凋亡实验步骤：

1.制备阳性细胞:选择1盘10cm皿细胞，打开培养皿盖子，放置于紫外灯下照射2小时。或使用碧云天细胞凋亡阳性对照试剂盒提前处理阳性细胞。

2.收集细胞：将待测细胞（包括阴性与阳性对照细胞）的上清分别收集至15mlEP中，使用2mlPBS冲洗细胞，加入1ml不含有EDTA的胰酶，至37°培养箱中消化，至细胞大片脱离皿底。用刚才收集的上清液终止消化后，转移至刚才的15mlEP管中。2000rpm，室温，离心5min，弃上清。

3.清洗细胞：用1ml常温undefinedPBS重悬细胞，转移至1.5mlEP管中。2000rpm，室温，离心5min，弃上清。

4．细胞计数：使用细胞计数仪进行细胞计数，每组取undefined106细胞。

5.染色：使用200ul缓冲液重悬细胞（undefined106），所有实验组与阴性对照需要双染，阳性对照需要设置两个染料的单染管。双染管加入5ul Annexin V染料，5ul7-AAD，单染管加入单独的5ul Annexin V染料或5ul7-AAD，标清楚单染染料名称。用手弹匀，避光染色15min。（染色过程中准备流式管和滤膜。打开流式细胞仪，检查鞘液和废液情况）

6.染色完毕后，加入1mlPBS，2000rpm，室温，离心5min，弃上清。再加入100ulPBS重悬，过200目滤网。

1、形态学观察方法

（1）HE（苏木精 — 伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。

（2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。

（3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。

（4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。

2、DNA凝胶电泳

细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。

正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。

3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定

凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。

凋亡检测有以下几种方法

一、基于细胞形态的法

电子显微镜检测方法：

电镜检查是鉴定凋亡的金标准。

在透射电镜下，凋亡细胞体积变小。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei），染色质高度盘绕，出现许多空泡结构；Ⅱa 期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；凋亡晚期出现核解体，产生凋亡小体。

细胞核形态染色法

相比细胞凋亡的其他形态变化，利用荧光染料配合荧光显微镜对细胞核形态的观察也是较为直接的指标。常用的 DNA 特异性染料有：Hoechst、DAPI以及碘化丙啶(PI)。Hoechst 是与 DNA 特异结合的活性染料；DAPI 为半通透性，用于常规固定细胞的染色；PI不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来（Annexin-V/PI法）。

二、基于生物学功能的方法

Annexin-V/PI双染色法

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）位于正常细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin V是一种Ca2+依赖磷脂结合蛋白，对PS具有高度亲和力。将荧光标记（FITC、PE或 biotin）的Annexin V作为探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。AnnexinV联合PI法更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法

线粒体膜电位检测

线粒体跨膜电位的下降也是凋亡细胞一个重要特点，是细胞凋亡过程中最早发生的事件（早于核形态的变化和PS的外翻）。一旦线粒体跨膜电位崩溃，细胞就会进入不可逆的凋亡过程。一些亲脂性阳离子荧光染料如 Rhodamine 123、DiOC6、JC-1、TMRM等，在线粒体跨膜电位存在的情况下可结合到线粒体基质，通过荧光显微镜观察其荧光的增强或减弱可反应线粒体内膜电负性的增高或降低。

以下是一种常见的细胞凋亡检测实验方法，以及一些基本要求：

1. Annexin V/PI双染法：这是一种常用的细胞凋亡检测方法，利用荧光染料Annexin V和PI（胞内外核酸染料）来区分细胞凋亡的不同阶段。步骤如下：

a. 收集待检测的细胞样本，并用合适的培养基洗涤细胞。

b. 用缓冲液悬浮细胞，并加入Annexin V荧光染料和PI染料。

c. 在暗处孵育细胞悬液一段时间（通常为15分钟至30分钟）。

d. 使用流式细胞仪或荧光显微镜分析样本中细胞的荧光强度，根据Annexin V和PI的结合情况确定细胞的状态。

2. 要求：

a. 无菌条件：实验操作应在无菌条件下进行，以防止细胞的污染。

b. 细胞类型：确定所使用的细胞类型，并了解其特点和响应特性。

c. 细胞密度：在实验中使用适当的细胞密度，以确保结果的准确性和可重复性。

d. 正、负对照：同时包含正向（凋亡诱导剂处理的阳性对照）和阴性对照（未处理的样本），以验证实验结果的可靠性。

e. 仪器和荧光染料：使用流式细胞仪或荧光显微镜等适当的设备，并选择合适的荧光染料，以便观察和分析细胞状态。