激光扫描共聚焦显微镜技术

激光扫描共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscopy，LSCM）是20世纪80年代发展起来的一项高新技术，是当今最先进的分子生学分析仪器之一。

LSCM利用激光作为光源，在传统荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，通过使探测点与照明点共轭，有效地抑制来自非焦平面的荧光，从而具有高度纵向分辨率。使用紫外或可见光激发荧光探针，利用计算机软件进行图像处理，可得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。

激光扫描共聚焦显微镜成像原理如图1-10所示，激光器发出的激光束经过扩束透镜和光束整形镜，变成一束直径较大的平行光束，长通分色反射镜使光束偏转90° ，经过物镜会聚在物镜的焦点上，样品中的荧光物质在激光的激发下向各个方向发射荧光。

只有在物镜的焦平面上发出的荧光经过物镜、长通分色反射镜、聚焦透镜会聚在聚焦物镜的焦点处，再通过焦点处的针孔，由检测器接收（实线），其他位置发出的光均不能过针孔（虚线）。由于物镜和会聚透镜的焦点在同一光轴上，因而称以这种方式成像的显微镜为共聚焦显微镜。

在成像过程中针孔起着关键作用，针孔直径的大小不仅决定是以共聚焦扫描方式成像还是以普通光学显微镜扫描方式成像，而且对图像的对比度和分辨率有重要的影响。

当激光逐点扫描样品时，针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，并将之转化为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。

一个微动步进电机（最小步距可达0.1 μm）可驱动载物台的升降（沿z轴），使焦平面依次位于标本的不同层面上，可以逐层获得标本相应的光学横断面的图像，这称为“光学切片”（optical sectioning）。

再利用计算机的图像处理及三维重建软件，可以得到高清晰度三维原色图像，并可沿x、y、z轴或其他任意角度来显示图像，还可沿x、y、z轴或其他任意角度来表现标本的外形剖面，十分灵活、直观地进行形态学观察。

若间歇或连续扫描样品的某一个横断面（或一条线）并对其荧光进行定位、定性及定量分析，即可实现对该样品的实时监测。

激光扫描共聚焦显微镜技术用于细胞膜及其受体、细胞内抗癌药物定位、细胞耐药机制、活体细胞中离子、pH值变化、神经递质、荧光原位杂交、细胞骨架、基因定位、原位实时PCR产物分析、荧光漂白恢复、胞间通信、共定位、蛋白质间作用及膜电位与膜流动性等研究。

LSCM已广泛应用于细胞生物学、生理学、病理学、解剖学、胚胎学、免疫学和神经生物学等领域。

器材：

盖玻片，激光扫描共聚焦显微镜。

试剂：

①PBS：8.0 g／L NaCl，0.20 g／L KCI，1.56 g／L Na₂HPO₄·H₂O，0.20 g／L KH₂PO₄,pH 7.4

②pH7.4

③4％ 多聚甲醛

④TPBS，含0.2％ Triton-X100的PBS

⑤一抗分别为兔抗肌动蛋白（actin）多克隆抗体、鼠抗-微管蛋白（tublin）单克隆抗体

⑥二抗分别为FITC标记抗兔IgG、TRITC标记抗鼠Ig

⑦Fluo-3AM 贮存液的配制：Fluo-3AM 100 μg充分溶于88.5 μl无水二甲基亚砜（DMSO），此贮存液浓度为1000 μmol／L。-20 ℃下避光保存，最好在4周内使用。

激光扫描共聚焦显微镜技术以细胞骨架的观察为例，其基本过程可分为如下几步：

B. PBS漂洗。

C. 分别经水化、TPBS透化细胞、5％ 牛血清白蛋白封闭后，加入兔抗肌动蛋白多克隆抗体、鼠抗-微管蛋白单克隆抗体（1：100稀释）的一抗，室温孵育2 h。

D. TPBS洗3次。

E. 加入FITC标记抗兔IgG、TRITC标记抗鼠1gG的二抗，室温孵育1h。

F. TPBS洗3次。

G. 甘油封片后立即进行激光扫描共聚焦显微镜观察。

H. 检查仪器的各开关，确保均处于关闭状态，然后接通总稳压器电源开关。

I. 荧光显微镜：先接通透射光源（卤素灯），调节灯电流使之适应观察样品；再接通汞稳压电源。开启汞灯后，必须使其工作1h再关闭，并需等其冷却15～20 min后方可再次启动，尽量减少开关次数以延长汞灯寿命。

K. 开启扫描器电源。打开计算机显示器及主机开关，进入操作系统。

2. 一般开机或改变激光功率后，约需20 min激光光源才能达到稳定。

3. 在同时使用2种或2种以上荧光探针时，尽量选择相互之间无光谱交叉、荧光强度匹配的探针。

4. 对组织切片标本，首先注意切片的厚度；由于组织切片在固定的过程中会带入干扰荧光，所以需注意组织样品固定剂的选择。

5. 对细胞标本要注意细胞种类、纯度、密度及细胞形态的选择。

6. 对于易猝灭的荧光样品，不要对同一样品进行多次测量，否则激光照射可引起不同程度的荧光猝灭，改变荧光强度而带来实验误差。

7. 激光扫描共聚焦显微镜要远离电磁辐射源，环境无振动，注意室内保持无尘，因为灰尘可影响光路系统和成像质量。