激光扫描共焦显微镜技术及应用

样品要求：
1.经荧光探剂标记(单标、双标、三标）
2.固定的或活的组织
3.固定的或活的贴壁培养细胞(Confocal专用小培养皿，盖玻片)
4.悬浮细胞，甩片或滴片后，用盖玻片封
一. 组成
倒置或直立荧光显微镜、扫描头(照明针孔、探测针孔、荧光滤片系统、镜扫描系统和光电倍增管)、扫描头控制电路、计算机和图像输出设备
二. 原理
Confocal
利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共轭的，因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到共焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像。
三. 激光扫描共焦显微镜的设计特点:
1.点照明
2.具有照明pinhole和探测pinhole
3.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦), 共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面
4.具有扫描系统―― 逐点扫描成像
5.具有多个（四个） 荧光通道，可同时探测多个被标记物
Leica TCS NT 的技术指标:
1. xy分辨率比传统显微镜小1.4x
传统显微镜: Rxy=0.61l/NA
Confocal: Rxy=0.4l/NA
2. 样品的最大厚度:大约 2mm(10X/0.2物镜)
取决于三点:
物镜的景深, 与NA成反比
Z轴的最大移动范围
激光的穿透力
3. 样品的最小光切厚度: 大约0.35 mm
取决于两点: 物镜的数值孔径NA
Z轴的最小移动步距: 40nm
Z轴的分辨率: 0.35 mm
4. 激光器
Kr/Ar激光器: 477nm, 488nm, 568nm, 647nm
Ar激光器(UV): 361nm
激光器的特点:
1) 方向性好: 激光基本眼直线传播
2) 单色性好 l=10-8nm
3) 高亮度: 激光方向性好,其在空间上的能量分布是高度集中的
4) 偏振性: 激光为平面偏振光, 光纤耦合
5. 四个荧光通道, 一个透射光通道, 即除了可同时采集
多标记荧光图像外还可以同时采集透射光图像,但透
射光图像为非共焦图像
四. 共焦显微镜的类型：
1.点(慢)扫描共焦显微镜: 分辨率高, 图像清晰;
噪音低;
采集图像速度慢;
目镜中观察不到共焦图像;
2.线(狭缝)扫描共焦 显微镜(video rate): 分辨率低;
噪音高;
扫描速度快 240幅/秒;
目镜中可观察到共焦图像
3.Nipkov转盘式扫描共焦显微镜: 性能介于上述两者之间
功能:1.多荧光标记样品的图像采集
2.无损伤、连续光学切片，显微“CT”
3.真正的三维重组
4.假三维图的显示
5.可沿Z轴（xy平面）和Y轴（xz平面）方向进行光切
6.定量分析
7.xyt 、xzt、xyzt 和 xt 扫描―― 时间序列扫描
8.图像处理
9. 旋转扫描
10.区域扫描
11.光谱扫描
五、激光扫描共焦显微镜技术的应用
定位、定量
三维重组
动态测量
¨ 活细胞或组织内游离Ca2+浓度的测量
¨ 活细胞内H+浓度（ pH值）的测量
¨ 自由基的检测
¨ 药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量
应用：细胞膜电位的测量
荧光漂白恢复（FRAP）的测量
笼锁解笼锁的测量
荧光能量共振转移（FRET）的测量
其他应用
1、定位、定量
免疫荧光标记（单标、双标或三 标）的定位、定量。如：细胞膜受体或抗原的分布，
微丝、微管的分布、 两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位
细胞凋亡: AnnexinV-fitc + PI
末端原位杂交-fitc + PI
荧光原位杂交： 染色体基因定位
单细胞凝胶电泳
GFP的表达
游离Ca2+ 的分布与定量
定位、定量研究中常用荧光探针
1）Amine-Reactive Probes与抗体耦联、与配体耦联、与肽耦联、与人工合成的寡聚核苷酸耦联的探针，可用于免疫组化、荧光原位杂交、受体标记等
2）FITC (fluorescent isothiocyanate) BODIPY FL 503/512
3）异硫氰基荧光素 494/518
4）TRITC 四甲基异硫氰基罗丹明 544/572 BODIPY TMR 543/569
5）Texas Red 德州红 595/615 BODIPY TR592/618
6）PE 藻红蛋白 565/578
7）cy3 490/530
8）cy5 650/690

(1)细胞表面抗原、胞内某种蛋白
免役荧光标记： 与抗体耦联,
直标: 一抗+荧光探针
间标: 二抗+荧光探针 如: 微管蛋白 抗 tublin抗体+荧光探针 肌动蛋白 Palloidine+荧光探针
(2)细胞膜表面受体
配体+荧光探针 如: nAchR、mAchR、多巴胺受体(D1,D2)
标记 Gm1: 霍乱毒素受体 霍乱毒素+FITC

2.标记细胞器荧光探针
(1)线粒体 Mitochondria Rodamin 123 505/534 ，可染活细胞，阳离子性,可检测线粒体膜电位, 且在多数细胞中停留时间短
JC1 线粒体膜电位低时为单体 490/527 发绿光
线粒体膜电位低时为多聚体 490/590 发红光
可标记活细胞线粒体，且为检测线粒体膜电
位最佳探针: Mitotracker Green FM 490/516, 染活细胞或固定细胞 ,
稳定不漏出: Mitoracker Orange CMTMRos 551/576, (氧化型)Mitoracker Orange 还原型, 只能染活细胞
(2)溶酶体 Lysosome中性红 541/640: 微偏碱性, 可标记溶酶体等酸性器官为非特异性
AO : LysoTracker Green DND-26 504/511, 染活细胞 LysoTracker Blue LysoTracker Red
(3)内质网 Endoplasmic Reticulum DiOC6 484/500: 非特异性, 较高浓度标记内质网,较低浓度标记线粒体
(4)高尔基体 Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536, 可染活或死细胞 ¨细胞器的单克隆抗体
(5)细胞核 PI propidium iodide 536/617 DNA/\RNA 死细胞
碘化丙啶EB ethidium bromide 518/617 DNA/RNA 死细胞
Hochest 33342 352/461 DNA A-T 活细胞
Hochest 33258 (同上)
DAPI 358/461 DNA A-T 半通透细胞
Chromomycin A3 450/470 DNA G-C
AO 500/526 DNA 活细胞
460/650 RNA TOTO-1 514/533 DNA 死细胞
SYTO 活细胞
3. GFP 绿色荧光蛋白
GFP的的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发光蛋白(aequoren)，该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母整体几提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白 GFP, 后经研究表明，在水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合后，水母发光蛋白产生蓝色荧光，GFP在蓝光的激发下，产生绿色荧光 。将外源基因与GFP DNA 相连, GFP可作为外源基因的报告基因实时监测外源基因的表达.
GFP主要应用: 对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察
如: 可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中的时空表达
GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞, 可动态观察该分泌蛋白分泌到细胞外的过程
GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能显示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的
结构及病理过程:定位与定量测量应注意的问题
定位：1.可以对图像进行修饰，
2.pinhole 可尽可能的小。
3.确认共定位时要取两个通道荧光相互干扰的对照图像
定量：
1.仪器的各个条件必须一致
2.必须用原始图像进行定量测量
3.Pinhole尽可能的大
六.显微CT与三维重组
光切的层数：VoxelsizeZ £ 2VoxelsizeX
七.动态测量 Physiology:细胞内离子动态变化测量
1).游离Ca2+测量
检测游离Ca2+变化荧光探针的原理：这类探针多为Ca2+螯合剂，不与Ca2+结合时不发荧光，通常也不能进入细胞膜，只有与乙酰甲酯AM相连方可进入细胞内，被细胞内酯酶水解后并与胞内游离钙结合后发出荧光。Kd值为Ca2+解离常数，表明检测Ca2+浓度的范围:0.1xKd-10xkd, Kd和很多因素有关，如pH、 Mg2+、与蛋白的结合、温度等。细胞内生理Ca2+浓度值(10-100n M)，细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）
荧光探针 激发波长 发射波长 Kd
FLuo3-AM, K+, dextran 506nm 525nm 390nM
Fluo4 506nm 525nm
Calcium Green-1 507nm 530nm 190nM
Calcium Green-2 507nm 535nm 550nM
Fura red 420/480nm 637nm 140nM
Oregon Green 488 494nm 520nm 20,000nM
Calcium Crimson 583nm 602nm 328nM
Indo-1 356nm 405/458nm 230nM
Fura-2 340/380 476nm 145nM
相对 测量

DF/F=(F-Fbase)/(Fbase-FBG)
Ca2+浓度绝对测量
单波长公式法
Fluo3: 530nm Kd=450nM
[Ca2+]I =Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)
Fmin: 细胞内无钙时的荧光强度( MnCl2)
Fmax：细胞内钙饱和时的荧光强度(A23187)
测量时切记细胞内静息Ca2+浓度的相对荧光强度值不能太低（F值不低于40）
细胞内生理Ca2+浓度值（10-8 -10-7 M）
细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）
标准曲线法：根据仪器条件和负载条件，以不同Ca2+浓度的Buffer(EGTA- Ca2+)做标准曲线，横轴为Ca2+浓度，纵轴为荧光强度
比例荧光的测量：双波长(比例荧光：ratio) Indo1(360, 420/480), fura2(340/380, 440)[Ca2+]I =Kd(R-Rmin)/(Rmax-R)Ff2/Fs2
细胞器的Ca2+测量
1.线粒体内游离Ca2+测量 Fluo-3 + TMRM(线粒体荧光探针，红色）
2. 特异定位的重组水母发光蛋白 水母发光蛋白与 Ca2+结合后发蓝光 用含有水母发光蛋白和含有特定细胞器蛋白的表达载体转染细胞，可测定亚细胞器内的游离Ca2+变化 目前已商品化的探针可检测：线粒体、内质网、细胞核内的游离Ca2+，因生物发光很弱不能使用Confocal检测
细胞内游离Ca2+测量的应用：
钙的特性
1．细胞内外的电化学梯度103-104倍
2．细胞膜渗透性稍有改变或钙库释放稍有增加，导致胞内钙明显升高
3．细胞内钙为细胞激活“开关”
细胞内钙的生理作用
1．肌肉的兴奋收缩-收缩偶联
2．神经递质的释放
3．学习记忆的增强
4．卵子受精
5．细胞分裂和再生
6．细胞调亡
7．细胞间通讯
8．细胞信号传导
9. DNA合成
10. 基因表达
细胞内钙超载与疾病
1．高血压、脑缺血、心脏病、内分泌病―胞内钙浓度异常
2．糖尿病、风湿性关节炎、多发性硬化病―胞内钙浓度增高
3．人体缺钙―骨钙大量丢失，神经细胞的钙浓度增高
4．老化和老年性痴呆-神经细胞内钙浓度增高
细胞内生理Ca2+浓度值（10-8 -10-7 M），细胞内Ca2+超载浓度值（基础Ca2+浓度的10倍左右）
八.荧光漂白恢复(FRAP: Fluorescence Recover after photobleaching)
定义:经荧光探针标记的细胞的某一区域一旦被高强度的激光照射后,荧光物质的光化学结构被迫坏,荧光强度下降, 且为不可逆的过程, 但此处荧光强度会渐渐恢复, 荧光强度和恢复的快慢和多少,代表周围分子扩散的速率, 或分子运动速度。
R=(I2-I1 /I0-I2)100%
R-荧光漂白恢复率：代表分子的运动速度
应用：细胞间通讯， 细胞膜流动性，蛋白分子的运动
九.笼锁解笼锁的测量
定义：笼锁化合物全称为光致不稳定笼锁化合物，为人工合成的用隐蔽基团修饰生物活性分子的化合物，一旦被紫外光照射，两者间的共价键几解离而释放出活性分子，这一光解作用称为解笼锁。
笼锁化合物的种类：笼锁的神经递质、笼锁的第二信使、笼锁钙等
十．荧光能量共振转移( fluorescence Resonance Energy Transfer)能量转移：能量从分子的一个部位向另一个部位的传递，或能量从一个分子向另一个分子传递。能量的提供者叫能量供体，能量的接受者叫能量受体。
能量共振转移：分子可以看作为正负电荷分离的一个偶极子，受激发以一定的频率振动，如果其附近有一个振动频率相同的另一分子存在，则通过这两个分子之间的偶极-偶极相互作用，能量可以非辐射方式从前者转移到后者，这种能量转移称为共振转移。
荧光能量共振转移的条件
两个荧光分子：供体-FL1，受体-FL2供体与受体的距离在2-7nm，供体的发射波长与受体的激发波长一致
检测：
以FL1的激发波长的光照射样品，没有共振转移时，只检测到 FL1的发射光(绿光)，发生共振转移时，就可检测出FL1的荧光(绿光)减弱，FL2(红光)的增强。
应用：检测大分子的相互作用
大分子构象的改变(蛋白)，例：大分子(亚基)的结合与分离
受体与配体的结合 ，常用荧光探剂：FITC/TRITC, Cy3/Cy5, BFP/GFP
十一 .其它应用
生物材料,例: 细胞在生物材料中的生长状态及分布
激光扫描共焦显微镜的发展趋势：
连续光谱型Confocal
多光子激光扫描显微镜