激光扫描共聚焦显微镜技术原理

光学显微镜作为细胞生物学的研究工具，可以分辨出小于其照明光源波长一半的细胞结构。随着光学、视频、计算机等技术飞速发展而诞生的激光扫描共聚焦显微镜 (Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)，则使现代显微镜有能力研究和分析细胞在变化过程中的结构。特别是对活细胞离子含量变化的定量检测、完整细胞的三维立体结构图像重建等方面，是传统的光学和电子显微镜所望尘莫及的。

Marvin Minsky于1957年提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，并获得了美国的专利。Egger和Petran1967年成功的应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面。1970年，牛津和阿姆斯特丹同时向科学界推荐了一种新型的扫描共聚焦显微镜。

1977年作为牛津集团成员的Sheppard和Wilson首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学。1984年Bio-Rad公司推出了世界第一台共聚焦显微镜商品，型号为SOM-100，扫描方式为台阶式扫描。

1986年的MRC-500即改进为光束扫描，用作生物荧光显微镜的共聚焦系统，即后又推出了MRC-600、MRC-600uv、MRC-1000、MRC-1000uv。

1987年，White和Amos在英国《自然》杂志发表了“共聚焦显微镜时代的到来”一文，标志着LSCM已成为进行科学研究的重要工具。随后Zeiss、Leica、Meridian等多家公司相继开发出不同型号的共聚焦显微镜。随着技术的不断发展和完善，产品的性能也不断改进和更新，应用的范围也越来越广泛。

　　一、基本原理

传统的光学显微镜使用的实际上是场光源，由于光散射，在所观察的视野内，样品上的每一点都同时被照射并成像，入射光照射到整个细胞的一定厚度，位于焦平面外的反射光也可通过物镜而成像，使图像的信噪比降低，影响了图像的清晰度和分辨率。

此外，传统的光学显微镜也只能对局部作平面成像。LSCM脱离了这种模式，采用激光束做光源，激光束经照明针孔，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本内焦平面上的每一点进行扫描（见图20-1）。

然后，激发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔时先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管(photomultiple tube， PMT)探测收集，并将信号输送到计算机，在彩色显示器上显示图像。在这光路中，只有在焦平面上的光才能穿过探测针孔，焦平面以外区域射来的光线在检测小孔平面是离焦的，不能通过小孔。

因此，非观察点的背景呈黑色，反差增加成像清晰。由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，即共聚焦。以激光做光源并对样品进行扫描，在此过程中两次聚焦故称为激光扫描共聚焦显微镜。

　　二、基本构造（以MRC-1024为例）

LSCM，是将光学显微镜技术，激光扫描技术和计算机图像处理技术结合在一起的高技术设备。其主要配置有激光器、扫描头、显微镜和计算机四大部分（图20-2）。包括数据采集、处理、转换及相应应用软件，图像输出设备及光学装置(如光学滤片，分光器，共聚焦针孔及相应的控制系统)。

1. 激光器　MRC-1024型LSCM采用的是气冷式氪－氩离子混合激光管，输出功率为15mw，激发光波长为488nm、568nm及647nm。激光束通过光纤电缆导入扫描头。

2. 扫描头　扫描头由三部分组成：

①探测通道，由光电倍增管和相应的共焦针孔及滤过轮组成。

②滤光块，本机配有做细胞标记用的T1/T2A滤光块；有测活细胞钙离子的B1及Open滤光块，测pH及其他离子，可根据标本不同进行选择。

③扫描透射探测器(非共焦模式)，是用于透射光观察样品，扫描头有管道与光学显微镜相连接。

3. 光学显微镜　可配置直立或倒置显微镜，本机为Zeiss Axiovert 100型倒置显微镜。相应的镜头倍率和数值孔径如表20-1所示。

4． 计算机及界面（1997年原始配置）

（1）计算机：硬件，内存32MB，硬盘1GB；软件包括用于图像采集和分析的OS/2、Win3.1等和测定钙离子的Time-Course/Ratiometric等软件。

（2）MRC-1024 共聚焦界面：硬件为24比特图像获得及显示卡和相应软件Lasersharp等。

（3）17寸彩色监视器：分辨率1280×1024。