激光扫描共聚焦显微镜基本原理

激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope，LSCM)是在荧光显微镜成像基础上配置激光光源和扫描装置，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦装置，利用计算机进行图像处理，对观察样品进行断层扫描和成像，是一种高敏感度与高分辨率的显微镜，在生命科学领域的组织、细胞 和分子水平研究中的应用十分广泛，主要用于样品荧光定量检测，共聚焦图像分析，三维图像重建、活细胞动力学参数分析和细胞间通讯等方面研究。

激光扫描共聚焦显微镜以激光作为光源，激光器发出的激光通过照明针孔形成点光源， 经过透镜、分光镜形成平行光后，再通过物镜聚焦在样品上，并对样品内聚焦平面上的每一点进行扫描。

样品被激光激发后的出射光波长比入射光长，可通过分光镜，经过透镜再次聚焦，到达探测针孔处，被后续的光电倍增管检测到，并在显示器上成像，得到所需的荧光图像，而非聚焦光线被探测针孔光栏阻挡，不能通过探测针孔，因而不能在显示器上显出荧光信号。这种双共轭成像方式称为共聚焦。因采用激光作为光源，故称之为“激光扫描共聚焦显微镜”。

激光扫描共聚焦显微镜通过对样品X-Y轴的逐点扫描，形成二维图像。如果在z轴上调节聚焦平面的位置，连续扫描多个不同2位置的二维图像，则可获得一系列的光学切片图像。在相应软件的支持下，通过数字去卷积方法(deconvolution)得到清晰的三维重建图像。正因为激光扫描共聚焦显微镜能沿着z轴方向在不同层面上获得该层的光学切片，所以可以得到组织细胞各个横断面的一系列连续光学切片，实现细胞“CT”功能。

激光扫描共聚焦显微镜原理模式图

激光扫描共聚焦显微镜二维图像

原代培养端脑细胞神经球中波形蛋白免疫反应阳性呈绿色荧光。乙酰胆碱转移酶免疫反应阳性呈红色荧光。两者共存时呈黄色荧光