RNA干扰技术的基本原理有哪些？

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。基因沉默，主要有转录前水平的基因沉默(TGS)和转录后水平的基因沉默(PTGS)两类：TGS是指由于DNA修饰或染色体异染色质化等原因使基因不能正常转录；PTGS是启动了细胞质内靶mRNA序列特异性的降解机制。有时转基因会同时导致TGS和PTGS。

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是通过抑制转录后水平的基因表达而诱导功能缺失表型的有力工具。由dsRNA（double-stranded RNA）引发的特定基因表达受抑制现象称为RNA干扰作用。

dsRNA（double-stranded RNA）可以介导基因沉默作用，以dsRNA为基点研究基因沉默的分子机制成为热点。dsRNA指的是大于30个碱基对的RNA分子。哺乳动物细胞有至少2条路径竞争双链RNA(dsRNA)，其一是特异性路径：特殊dsRNA的序列用于RNAi，起始阶段dsRNA被切成siRNA（small interfering RNA 或short interfering RNAs）。siRNA是RNA干扰作用赖以发生的重要中间效应分子，能提供一定的信息，允许一个特定的mRNA被降解。siRNA正义链与反义链各有21个碱基，其中19个碱基配对，再每条链的3’端都有2个不配对的碱基。

另一条是非特异性路径：只要有长的dsRNA的存在它可以降解所有的RNA，抑制所有蛋白质的合成。长的dsRNA激活蛋白激酶PKR，激活的PKR通过一系列的磷酸化关闭翻译起始因子，导致翻译抑制。也可以通过激活2’－5’AS 合成一个分子激活RNase L，导致非特异的RNA降解。

关于特异性的RNA作用机制模型，包括起始阶段和效应阶段。起始阶段dsRNA在Dicer酶（RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员，属内切核酸酶）的作用下加工裂解21－23核甘酸长的小分子干扰RNA片断（siRNA）。Dicer含有解旋酶活性以及dsRNA结合域和PAZ结构。

在RNAi 的效应阶段，siRNA双链结构解旋并形成有活性的蛋白/RNA复合物（RNA－induced silencing complex or RISC），在siRNA 解双链即RISC激活过程需一个ATP。由RISC中siRNA反义链与mRNA互补区域结合，随后切割mRNA从而达到在RNA水平干扰基因表达。RISC由多种蛋白成分组成，包括核酸酶，解旋酶和同源RNA链搜索活性等。

RNA干扰(RNAi)技术的基本原理主要包括以下几点:

1. 引入双链RNA(dsRNA):外源性引入大小约20-25nt的小分子dsRNA。

2. Dicer酶切成siRNA:细胞内Dicer酶会识别并切割长的dsRNA,生成小的siRNA。

3. siRNA与mRNA互补结合:siRNA作为RNA诱导沉默复合体(RISC)的一部分,与目标mRNA的互补序列特异性结合。

4. mRNA降解:结合后的mRNA会被RISC内的酶如Argonaute消化降解,从而抑制基因表达。

5. 序列特异性抑制基因:不同序列的siRNA可抑制不同的目标基因,实现对特定基因的敲低。

6. shRNA持续敲低:将siRNA序列克隆到vectors中构建shRNA,可在细胞内表达并持续敲低效果。

7. miR30backbone:在miR30的前体构建backbone内可设计siRNA序列,产生人工miRNA实现RNAi。

8. CRISPR干扰:基于dCas9的CRISPRi系统可用gRNA靶向基因导致转录抑制。

综上,RNAi主要通过引入双链小分子RNA抑制同源mRNA的降解,从而实现对基因表达的靶向调控。

所谓RNA干扰(RNAi)技术就是利用一小段双链RNA(dsRNA)导入人体或其他哺乳动物细胞中使特定的基因表达产生沉默。基因表达沉默的原因在于真核细胞有一种天然的防御机制能对侵入细胞的外源dsRNA产生应答激发细胞产生一种称为Dicer的RNA酶Dicer将入侵的外源dsRNA切割成22～25 bp大小的许多小片段这些小段双链RNA称为小分子干扰RNA(siRNA)。同时siRNA又诱导组装出一种称为RNA诱导沉默复合物(R=ISC)的核酸酶 RISC与siRNA结合这时细胞自身的mRNA如果含有与此小片段即siRNA同源的序列就会被降解因此引起转录该序列的基因表达表现出沉默。实际上RNAi是一种操纵基因表达、使特定基因沉默的新技术它有望用于基因治疗或基因药物的研制)。