激光扫描共聚焦显微镜的基本原理和主要生物学应用

一、激光扫描共聚焦显微镜的基本原理和发展

科学研究工作对更高图像分辨率的追求产生了激光扫描共聚焦显微镜。

随着免疫荧光技术在生物学研究领域的广泛应用，研究人员注意到，荧光显微照片的分辨率较低， 传统的荧光显微镜使用场光源，因标本邻近结构（细胞或亚细胞结构） 产生的衍射光和散射光的干扰，使标本中细微结构的成像不够清晰。

激光共聚焦显微镜的主要原理是利用激光扫描束通过光栅针孔形成点光源，在荧光标记标本的焦平面上逐点扫描，采集点的光信号通过探测针孔到达光电倍增管（PMT），再经过信号处理，在计算机监视屏上形成图像。由于激光光源的光栅针孔和探测针孔对物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于光栅针孔和探测针孔，进行点扫描时，扫描点以外的点不会成像，经逐点扫描后才形成整个标本的光学切片（Optic section）。

二、图像激光扫描共聚焦显微镜的主要生物学应用

1、组织和细胞中荧光标记的分子和结构的检测

标本制备方法主要有免疫荧光组织和细胞化学法、荧光蛋白标记分子法、荧光细胞染料标记法等。与传统的荧光显微镜相比，除了有较高的分辨率以外，一个主要的不同是激光扫描共聚焦显微镜可以利用激光点扫描成像，形成所谓的“光学切片”，进而可以利用沿纵轴上移动标本进行多个光学切片的叠加形成组织或细胞中荧光标记结构的总体图像，因此可以用于观察切片和一些表面不平的标本，特别是研究具有长突起的神经元时更有使用价值。同时可以做三维图像重建和标记强度的半定量分析。

2、定量或半定量测量Ca²⁺ 和pH等细胞内离子浓度及变化

利用Fluo23 、Fura2等荧光探针可以测量Ca²⁺在活细胞内的浓度及变化。一般来说，电生理记录装置加摄像技术检测细胞内离子量变化的速度相对较快，但其图像本身的价值较低，而激光扫描共聚焦显微镜可以提供更好的亚细胞结构中钙离子浓度动态变化的图像，这对于研究钙等离子细胞内动力学有意义。最好与电生理等技术相结合来观察离子变化与电生理学指标的相关性。

3、荧光光漂白及恢复技术

利用高能量激光束将细胞内某一部分中选定靶区域的某种荧光淬灭，然后观察邻近相同的荧光标记物重新扩散入该区域的速度和方式，从而分析细胞内蛋白质运输、受体在细胞膜上的流动和大分子组装等细胞生物学过程。一般来说，需要用荧光蛋白等标记物标记需要研究的分子，进行细胞转染表达后再做以上的实验。

4、长时程观察细胞迁移和生长

目前激光扫描共聚焦显微镜的软件一般均可自动控制地进行定时和定方式的激光扫描，而且由于新一代激光扫描共聚焦显微镜的探测效率的提高，只需要很小的激光能量就可以达到较好的图像质量，从而减小了每次扫描时激光束对细胞的损伤，因此，可以用于数小时的长时程定时扫描，记录细胞迁移和生长等细胞生物学现象。

5、其他的生物学应用

用高能量激光束进行细胞损伤和损毁实验，一般要用紫外激光束进行细胞损毁；细胞间通讯研究；光解笼锁活化技术等。

三、激光共聚焦显微镜在以下研究领域中应用较为广泛：

1、细胞生物学：细胞结构、细胞骨架、细胞膜结构、流动性、受体、细胞器结构和分布变化、细胞凋亡；

2、生物化学：酶、核酸、FISH、受体分析；

3、药理学：药物对细胞的作用及其动力学；

4、生理学：膜受体、离子通道、离子含量、分布、动态；

5、遗传学和组胚学：细胞生长、分化、成熟变化、细胞的三维结构、染色体分析、基因表达、基因诊断；

6、神经生物学：神经细胞结构、神经递质的成分、运输和传递；

7、微生物学和寄生虫学：细菌、寄生虫形态结构；

8、病理学及病理学临床应用：活检标本的快速诊断、肿瘤诊断、自身免疫性疾病的诊断；

9、生物学、免疫学、环境医学和营养学。