用蛋白质底物进行蛋白质激酶分析实验

一、Mg-ATP 储存液的配制 ATP 买来时通常是钠盐。大多数激酶需要 ATP 镁盐作为高效底物。有时可以用锰代替镁。 1. 20 mmol/L MgCl2 或 MgSO4 2. 20 mmol/L Na2-ATP 以 1:1 的比例混合这两种溶液，测 pH 值。慢慢将 pH 值调至 pH 7.4。如果出现沉淀，应继续搅拌，并要保持 pH 值在 pH 7.4。这就配成了 10 mmol/

1. 在置于冰上的离心管内配制含下列成分的 20 μl 反应混合物： 5X 激酶分析缓冲液 4 μl，10 mg/ml 组蛋白 2B 储存液 1 μl，[γ-32P] ATP（终浓度为 5 μCi/5 μmol/L ATP） 1 μl，水（取决于下一步所加的激酶样品的量） 0~14 μl 10X 环核苷酸依赖的蛋白质激酶分析缓冲液 20X 环核苷酸储存液 2. 往上述反应混合物中加 1~1

1. 在冰浴的离心管内配制如下 20 μl 反应混合物： 5X PKC 分析缓冲液 4 μl 10 mg/ml 组蛋白 HI 储存液 1 μl [γ-32P] ATP（终浓度 5 μCi/5 μmol/L ATP） 1 μl 水（取决于下一步所加的激酶样品的量） 0~14 μl 5X PKC 分析缓冲液： 100 mmol/L Tris-HCl，30℃ 时（pH 7.5) 25

1. 在置于冰上的离心管内配制含下列成分的 20 μl 反应混合物： 5X 酪蛋白激酶分析缓冲液 4 μl β-酪蛋白 1 μl [γ-32P] ATP（终浓度 5 μCi/5 μmol/L ATP） 1 μl 水（取决于下一步所加的激酶样品的量） 0~14 μl 10 mg/ml β-酪蛋白储存液 5X 酪蛋白激酶Ⅰ和Ⅱ分析缓冲液： 100 mmol/L

1. 制备酸变性的烯醇化酶 从兔肌肉中纯化的烯醇化酶通常以硫酸铵沉淀或者悬液的形式存在。 (1) 含 100 μg 的烯醇化酶，于 4℃ 全速离心 5 分钟。 (2) 去上清，加入含有 1 mmol/L DTT 的 10 μl 50 mmol/L HEPES 缓冲液（pH 7.0)，彻底混匀，冰浴 30~60 分钟。 (3) 加 10 μl 甘油，混匀，如果当天进行分析实验就放在冰上。

1. 准备下列材料： SDS-PAGE 要用到的所有试剂 50 mmol/L Tris-HCl，室温（pH 8.0)，1 mmol/L DTT 6 mol/L 盐酸胍，50 mmol/L Tris-HCl，室温（pH 8.0），1 mmol/L DTT 8 mol/L 尿素，50 mmol/L Tris-HCl，室温（pH 8.0)，1 mmol/L DTT 50 mmol/L Tris