用蛋白质底物进行蛋白质激酶分析实验

一、Mg-ATP 储存液的配制 ATP 买来时通常是钠盐。大多数激酶需要 ATP 镁盐作为高效底物。有时可以用锰代替镁。 1. 20 mmol/L MgCl2 或 MgSO4 2. 20 mmol/L Na2-ATP 以 1:1 的比例混合这两种溶液，测 pH 值。慢慢将 pH 值调至 pH 7.4。如果出现沉淀，应继续搅拌，并要保持 pH 值在 pH 7.4。这就配成了 10 mmol/

1. 在置于冰上的离心管内配制含下列成分的 20 μl 反应混合物： 5X 激酶分析缓冲液 4 μl，10 mg/ml 组蛋白 2B 储存液 1 μl，[γ-32P] ATP（终浓度为 5 μCi/5 μmol/L ATP） 1 μl，水（取决于下一步所加的激酶样品的量） 0~14 μl 10X 环核苷酸依赖的蛋白质激酶分析缓冲液 20X 环核苷酸储存液 2. 往上述反应混合物中加 1~1

1. 在冰浴的离心管内配制如下 20 μl 反应混合物： 5X PKC 分析缓冲液 4 μl 10 mg/ml 组蛋白 HI 储存液 1 μl [γ-32P] ATP（终浓度 5 μCi/5 μmol/L ATP） 1 μl 水（取决于下一

1. 在置于冰上的离心管内配制含下列成分的 20 μl 反应混合物：5X 酪蛋白激酶分析缓冲液 4 μl β-酪蛋白 1 μl[γ-32P] ATP（终浓度 5 μCi/5 μmol/L ATP） 1 μl水（取决于下一步所加的激酶样品

1. 制备酸变性的烯醇化酶从兔肌肉中纯化的烯醇化酶通常以硫酸铵沉淀或者悬液的形式存在。(1) 含 100 μg 的烯醇化酶，于 4℃ 全速离心 5 分钟。(2) 去上清，加入含有 1 mmol/L DTT 的 10 μl 50 mmol/L HEPES 缓冲液（pH 7.0)，彻底混匀，冰浴 30~60 分钟。(3) 加 10 μl 甘油，混匀，如果当天进行分析实验就放在冰上。(4) 马上分析前，

1. 准备下列材料： SDS-PAGE 要用到的所有试剂 50 mmol/L Tris-HCl，室温（pH 8.0)，1 mmol/L DTT 6 mol/L 盐酸胍，50 mmol/L Tris-HCl，室温（pH 8.0），1 mmol/L DTT 8 mol/L 尿素，50 mmol/L Tris-HCl，室温（pH 8.0)，1 mmol/L DTT 50 mmol/L Tris