酪氨酸激酶

烯醇化酶 酪氨酸激酶分析缓冲液

1. 制备酸变性的烯醇化酶

从兔肌肉中纯化的烯醇化酶通常以硫酸铵沉淀或者悬液的形式存在。

(1) 含 100 μg 的烯醇化酶，于 4℃ 全速离心 5 分钟。

(2) 去上清，加入含有 1 mmol/L DTT 的 10 μl 50 mmol/L HEPES 缓冲液（pH 7.0)，彻底混匀，冰浴 30~60 分钟。

(3) 加 10 μl 甘油，混匀，如果当天进行分析实验就放在冰上。

(4) 马上分析前，往烯醇化酶溶液加 20 μl 100 mmol/L 乙酸，彻底混匀。于 30℃ 水浴 5 分钟，然后放在冰上。

2. 在冰浴的离心管内配制如下 20 μl 反应混合物：

5X 酪氨酸激酶分析缓冲液                             4 μl 

酸变性的烯醇化酶                                        1 μl

[γ-³²P] ATP（终浓度 5 μCi/5 μmol/L ATP）    1 μl

水（取决于下一步所加的激酶样品的量）        0~14 μl

5X 酪氨酸激酶分析缓冲液：

100 mmol/L HEPES (pH 7.4)

5 mmol/L MnCl₂

5 mmol/L DTT

500 μmol/L Na₃VO₄

3. 加入 1~14 μl 激酶样品开始反应。

4. 于 30℃ 继续反应一定时间，然后加入 20 μl 冰冷的 2X SDS-PAGE 加样缓冲液终止反应。混匀后，沸水浴煮 3 分钟。然后可以用于 SDS-PAGE 分析、TCA 沉淀计数和/或放射自显影检测。