这些蛋白质互作实验方法，你都了解吗？

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）对解析生命活动过程与疾病发生发展过程至关重要。随着时代发展，虽然大规模、高通量的生物学研究手段大大促进了蛋白质相互作用的预测，但这种预测还需要进一步利用体外和体内系统进行验证。分析蛋白质互作的方法多种多样，本篇文章为大家介绍以下几种互作分析技术：

免疫共沉淀 Co-IP

免疫沉淀 （IP）、免疫共沉淀 （Co-IP）和 pull-down 都是常用的从复杂的混合样品中获取目标分子，以进行下一步分析的方法，如检测蛋白质能否相互作用。在此类实验中，被研究的蛋白质称为「诱饵」蛋白，「诱饵」蛋白的互作蛋白称为「猎物」蛋白。「诱饵」蛋白与「猎物」蛋白结合后，利用靶蛋白—抗体— Protein A/G —磁珠/琼脂糖珠的结合方式获取复合物，再通过 SDS-PAGE、Western blot 或质谱等方法进一步对复合物中的靶蛋白进行分析。

免疫共沉淀方法简单，是识别感兴趣蛋白质的相互作用、深入了解其结构和功能的初步实验方法。但是它也有相应的局限性，比如很难验证两种蛋白质是否直接发生相互作用、不能得到这种相互作用亲和力等定量信息等。因此需要在相互作用分析与筛选后，使用其他方法验证更详细的相互作用信息。

图 11：使用抗体进行 Co-IP 与使用 Strep-Tactin^®XT 进行pull-down

融合蛋白沉降 pull-down

IP 和 Co-IP 通过固定抗体来捕获诱饵蛋白质及其结合分子，而 pull-down 可使用带亲和标签的目的蛋白进行，在体外验证蛋白间的直接相互作用。Pull-down 是通过磁珠/琼脂糖填料固定带有标记的「诱饵」蛋白，从细胞裂解液、纯化蛋白或表达系统中捕获「猎物」蛋白，然后将复合物蛋白分离后进行凝胶或质谱分析，从而确认互作蛋白的「身份」。Pull-down 较 Co-IP 的优点在于，不仅能证实靶蛋白的直接相互作用，且洗脱条件也很温和，保留蛋白质结构与天然蛋白复合体的同时，又避免将非特异性结合的蛋白质共同洗脱下来，确保了后续分析的准确性。这一优点在 Strep-tag 技术中充分体现。图 12 为应用 MagStrep「type3」XT 磁珠进行蛋白质 Strep pull-down 步骤图。

图 12：Strep pull-down 互作蛋白质分析示意图。A：Strep-Tactin^®XT 包被磁珠；B：固定带有 Twin-Strep-tag^® 标记的「诱饵」蛋白；C：孵育「诱饵」蛋白与含有「猎物」蛋白的溶液；D：「猎物」蛋白与「诱饵」蛋白形成复合物；E： 复合物蛋白进行凝胶分析；F：复合物蛋白进行质谱分析。

表面等离子共振 SPR

表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）技术是一种基于物理光学现象的检测技术，是分析生物分子间结合作用的常用方法之一，通过直接、实时、无标记的测量来分析分子间的亲和力及动力学参数，在生物治疗药物的发现和开发中发挥着重要作用。

SPR 的原理是在芯片表面固定一层生物分子识别膜，然后将待测样品流过芯片表面，若样品中有能够与芯片表面的生物分子识别膜相互作用的分子，会引起金膜表面折射率变化，最终导致 SPR 角变化，通过监测 SPR 的角度变化，获得被分析物的浓度、亲和力、动力学常数和特异性等。

图 13：SPR 检测原理与 Strep-Tactin^®XT 包被的感受器晶片

图13 中所示的基于Strep-tag^®系统方法，采用是间接的捕获方式来分析目的蛋白，解决配体稳定性差、纯度低、再生困难的同时，可进行定向、高亲和力的配体固定，实现长解离时间和慢解离速率的测量，最小化非特异性结合。

生物膜干涉  BLI

生物膜干涉技术（Bio-Layer Interferometry, BLI）, 是一种无标记（Label-free）光学生物传感技术，用于实时监测分析生物分子相互作用（例如抗原-抗体相互作用），并对其结合强度和动力学进行量化分析。与 SPR 技术不同的是， BLI 技术中不使用金属芯片，而是利用生物传感器。将配体偶联在传感器的末端，浸入样品中来捕获分析物。

图 14：BLI传感器与  Strep-Tactin^®XT 相结合，特异性捕获  Twin-Strep-tag^®  融合蛋白

当光束射出后，对来自生物传感器末端表面的反射光进行测量，如果配体与分析物相互作用，则末端表面的膜层比仅有配体（未结合分析物）的膜层更厚，反射光波长也不同，两种反射光谱之间的波长形成一束干涉光谱。BLI 仪器通过测量来自配体，或配体-分析物的复合物的干涉光谱位移值，实现结合强度和动力学的实时监测。

邻近蛋白标记 BioID

邻近蛋白标记（biotin identification，BioID） 方法可以鉴定诱饵蛋白附近的蛋白质。通过将生物素连接酶（BirA）与诱饵蛋白融合表达，加入适量生物素，融合蛋白的相互作用/附近环境中的蛋白质会被生物素化。之后通过链霉亲和素或 Strep-Tactin^® 进行亲和纯化，将被生物素化的蛋白质从细胞裂解液中富集出来，产物做质谱鉴定。

图 15：BioID 的原理

以上即为几种常用的蛋白质互作研究方法，另外还有很多其他相关技术可以探索。

值得一提的是，文章中所用图示与示例均来自 Strep-tag^® 技术。