其他实验

通过静脉注射特洛伊木马脂质体（Trojan horse liposome, T H L , 也 称 为 P E G y -Iates免疫脂质体， P I L ) 包裹的DNA， 非病毒载体质粒DNA可经血管途径穿过血脑屏障传送人脑。 IOOnm的脂质体表面覆盖着数千个多聚体，如 2000D a 的聚乙二醇(P E G ) , 或 称 P E G 2000。 1 % 〜2 % 的 P E G 分子末

同源重组是基因组操作中最精确的一种方法。作为一个工具，同源重组已经广泛地用于细菌、酵母、鼠胚胎干细胞（E S ) , 以及其他一些特殊细胞系，但在其他系统如哺乳动物体细胞遗传学上还没有得到应用。最近的研究工作表明，在哺乳动物体细胞中，双链 D N A 发生基因特异的断裂，能够引起上千倍的同源重组。目前，利用锌指核酸酶(Z F N )，能够在哺乳动物基因组中形成这种双链断裂。 Z F N 是一种人工

有效地传递ΦC31整合酶和供体质粒到感兴趣的受体组织或细胞仍然是这一整合系统中最具挑战性的内容。不像利用病毒的方法对基因组进行操作，用 ΦC31整合酶几乎总是需要一个额外的方法来刺激细胞对DNA 的摄取。然而,相对简单的质粒系统意味着几乎所有已证明的可行的导人外源DNA 进入细胞的方法都能够用 ΦC31整合酶来实现。事实上，多种转染技术有时显示出适合于这方面的应用。作者：T.弗里德曼等,译者：殷勤

米非司酮诱导的基因调节系统（M I G R S ) 是通过抗孕酮药—米 非 司 酮 （M f p )来调控耙基因表达的体系。该体系利用一种反式激活嵌合蛋白质，此蛋白质重组了部分人孕酮受体的配体结合区（hPR-LBD)、源于酵母Gal4 转录因子的D N A 结合区以及反式激活区。在没有内源性孕酮存在的情况下， M f p 作为一种反式激活子结合于祀基因启动子内上游区域的激活序列，并启动靶基因转录。

生 物 可 降 解 纳 米 颗 粒 是 一 种 胶 体 颗 粒 ，一 般 直 径 在 IOOnm左 右 ，可 以 由 聚 乳 酸 -聚经 基 乙 酸 （P L G A ) 或 聚 乳 酸 等 生 物 可 降 解 聚 合 物 制 备 而 成 。这 些 纳 米 颗 粒 通 过 内 吞 作用 进 人 细 胞 ，并 且 研 究 证 明 它 们 可 以 快 速 从 溶 酶 体 逃 逸 ，从 而 保 护 纳

大量非病毒体系已经被用于体外培养细胞或体内特定细胞的核酸传递。它们在毒性、免疫原性和靶向特定细胞表面受体或细胞种类的能力等方面具有很大差异。 一 类含有 P-环糊精的线性阳离子聚合物在体内核酸传递中展现出了良好的效果，这些核酸包括质 粒 D N A 、 D N A z y m e 和小干扰R N A 。这类聚合物和核酸形成复合物（p〇 lyP lex)，并且可以进一步进行靶向配体（如转铁蛋白）的修

聚赖氨酸及其共聚物作为非病毒类基因载体获得了广泛的应用。尽管聚赖氨酸本身对细胞具有毒性，但通过共价键将聚乙二醇连接到聚赖氨酸链段后，细胞毒性大大降低 ，并且可以增加基因转染效率。我们还合成了可降解的聚赖氨酸的类似物聚氨丁基乙醇 酸 （polyaminobutyl glycolic acid)，以及十八 焼 基 化的聚赖氣酸 （Stearylpolylysine)用于传输D N A ，后者与低密度蛋

荧光原位杂交（FISH)需要核酸探针，包括直接用荧光素标记或者可以间接与荧光素相连接的脱氧核糖核酸（DNA)、核糖核酸（RNA)或核酸类似物。通过探针核苷酸与靶序列的核苷酸互补配对，使得FISH分析具有特异性。核酸连接的荧光基团使得在荧光显微镜下可观察到细胞结构中的同源区域。摄影照相或电子照相可获得永久性荧光染色图像，而且后者可以进行探针荧光的定量测定。

基 因 枪 技 术 是 一 种 快 速 而 又 简 单 地 将 基 因 运 送 到 细 胞 内 的 技 术 。这 种 技 术 有 很 多 优 点 ：可以直接输送质粒，不必像一些病毒载体系统那样构建复杂的生物载体。理论上，用基因枪技术能够将D N A 输送到任何细胞。 D N A 能穿透细胞壁、细胞膜、角质层或者其他保护性结构，而且，输送不受细胞表面受体或分子的限制。 作者：T.弗里德曼等,译者：殷

主 要 描 述 那 些 用 于 从 cDNA克 隆 中 恢 复 出 具 感 染 能 力 的 流 感 病 毒 的 方 法 。这 些 技 术 广 泛 地 应 用 于 外 源 基 因 的 整 合 和 表 达 、候 选 疫 苗 的 研 制 和 流 感 病 毒 复 制 的 研 究 。使 用 流 感 病 毒 作 为 抗 原 传 送 载 体 的 一 个 优 点 就 是 有 一 个 巨 大的 不 同 抗 原 的

S T A R 系 统 （6 个组氨酸标签和重新靶向）运用一个假受体和一个病毒的标签使全部再结合的病毒能被拯救和扩增，这些病毒已不能结合到天然的麻疹病毒的受体上。本操作规程提供了如何使用这个系统的详细的指示，使用这个系统，经过简单的三步操作就能迅速地产生具有新的靶向性的病毒。首先，编码靶向配体的c D N A 被克隆进一个嵌合H 蛋白的穿梭载体，这个载体能编码一个C 端有6 个组氨酸的多肽标签。

H S V -I 的自然生理特点包括在神经元中建立一种终生潜伏状态，病毒基因始终是一种游离性分子。已构建了能产生完全不能复制的、无毒性的、能长期表达转基因的 H S V 载体，也构建了能在特定细胞（如癌细胞）中保持复制能力的可复制重组型基 因 H S V 载体，并被利用到多形性胶质母细胞瘤患者临床试验的I 期 和 II期。最近的研究集中在将H S V 载体用于治疗非神经系统疾病。生产用于潜伏期效能

A A V 衣壳肽展示库、易错 P C R 和 D N A 改组 。可通过自然突变和重组产生不同组织嗜性的A A V 血清型，从而将 A A V 转导到一些难感的细胞类型中去。另外，可利用血清同源体，用核衣壳移植或标记拯救技术用不同的血清型构建杂合载体。因 为 A A V 2 是了解最为透彻的血清型，这个血清型一般被用来作为构建A A V 杂合载体的模板。本章主要介绍构建具有扩大的组织嗜性的杂合A

本节提供了多种对癌症患者的血液标本的细胞进行遗传学分析的实验方法。由于研究方便，白细胞很久以来一直被用来分析染色体重组。观察到标志性重组染色体，如费城染色体（Ph 染色体）有助于诊断和后续治疗。许多肿瘤特异性的标志染色体已经在白血病中被发现，它们的发现对于在早期选择适合的治疗方案非常重要。细胞遗传学分析还用于对骨髓移植后的移植物分型。

针对病毒载体骨架编码的蛋白质的免疫反应可能发生，这就限制了体内表达转基因载体的应用。尽管如此， A d 仍然是最有效和最通用的基因传递系 统 。 这里我们讨论当前的用于构建、扩增、纯化和鉴定第一代A d 载体的方法。 作者：T.弗里德曼等,译者：殷勤伟等，本实验来自「基因转移」

本试验方案描述了几种产生补体稳定的慢病毒载体的方法，这些方法是通过利用含有补体调节蛋白CD55 (降解加速因子， D A F ) 的融合包装蛋白来产生假型病毒质粒，或是采用天然的D A F 与包装蛋白共组装来产生新型的慢病毒。 作者：T.弗里德曼等,译者：殷勤伟等，本实验来自「基因转移」

大多数造血细胞 ，包括造血干细胞和终末分化细胞，如初生 T 细胞和巨噬细胞，是不分化或自我更 新缓慢的。对于这些细胞，大多数非病毒或反转录病毒转染方法是不可行的。慢病毒载体适用于转染未分化的细胞以及长效维持转基因的表达。带有各种基因的慢病毒载体已成功转染许多造血细胞。慢病毒载体可用于许多转载操作，如短发夹R N A (sh R N A )和功能基因的长效表达。它们在基因治疗方面也将有很大的潜力。

基于猫免疫缺陷病毒（F IV ) 的慢病毒载体对于介 导 整 合的转基因到非分裂的人体细胞是非常有用的。本章主要描述了生产和使用新一代F I V 载体的方法，讨论了 F IV和其他慢病毒载体相比较的关键特征，并提供了大规模/小规模载体生产的详细方案。此外，最近鉴定的种属特异的反转录病毒限制因素的实际应用和非整合的F I V 载体的生成也是本章讨论的主题 作者：T.弗里德曼等,译者：殷勤伟等，本实验

反转录病毒能非常好地被用来作为基因导入的工具是因为它们有特定的生命周期和能有效整合进入靶细胞DNA的能力。反转录病毒的基因组两侧连接着两个调控区，也被称作长末端重复序列（ LTR)，具有启动子和增强子的功能并且也是整合进入宿主基因所必需的。 作者：T.弗里德曼等,译者：殷勤伟等，本实验来自「基因转移」

基因打粑技术是建立在胚胎干细胞 (embryonic stem cell， E S 细胞) 和同源重组基础上的定点改变物种遗传信息的实验手段。首先在体外利用同源重组技术获得带有预先设计突 变的 E S 细 胞 ，即中靶 E S 细胞，随后将这种遗传修饰的 E S 细胞注入囊胚，获得嵌合体 ，然后将嵌合体与野生型个体交配，若 E S 细胞已整合入生殖系，在子一代中会获得 携带一条突变染色体的杂合子个