细胞实验锦囊

冻存前细胞较好，冻存时操作无误及试剂是新鲜的，则在 -80℃ 冰箱冻存的细胞一般半年左右复苏培养时完全没有问题；但若是长期不做，或阶段性实验完成，可将细胞转入液氮冻存，保证下次使用时的细胞是可用的。

1. 种植于 96 孔板中的细胞保证密度合适、细胞状态良好，8000-10000 个/孔细胞数量比较合适，也要看实验时间及个人培养的细胞生长速度；2. 加入 CCK-8 试剂时，枪头伸入液体以下迅速将 CCK-8 试剂加入培养基中，减少试剂在枪头残留，且要避免产生气泡，减少操作的误差，有条件建议使用多通道移液枪加 CCK-8 试剂，尽量减少每个孔之间的时间误差；3. 探索 CCK-8 最佳孵育时间

1. 固定时间太长会让细胞碎片增多；2. 重悬细胞不建议用旋涡震荡，可使用吸头吹吸，注意不要吹起气泡；3. 消化过度，可适当降低浓度或减少用量来降低胰蛋白酶消化对细胞的损伤；4. 传代后次日细胞换液，先用缓冲液漂洗两次以洗去未贴壁的细胞及细胞碎片，再加入新的培养液继续培养；5. 确保细胞是新鲜收集的，否则容易出现大量死细胞和碎片。

（1）制备活性高的单细胞悬液：用胰酶消化细胞，PBS 清洗 2-3 次，主要去除胰酶，然后使用完全培养基将细胞调整为 5×10^6-5×10^7 个 /ml 即得待检样本；（2）取 40 μl 细胞悬液加入预先有特异性 McAb（5-50 μl）的小玻璃管或塑料离心管，再加 50 μl 1:20（用 DPBS 稀释）灭活正常兔血清，置于 4℃ 30 min；（3）用洗涤液洗涤 2 次，每次加洗涤液

免疫荧光主要判断目的蛋白的定位，实验过程中会染表征细胞核的 DAPI。拿到免疫荧光结果，使用 PS 等软件进行 merge，如果染色结果只在 DAPI（蓝色）周围有一圈，即细胞膜定位；如果染色结果显示 DAPI 周围到处都有，即胞浆定位；如果染色结果和 DAPI 完全 merge，即细胞核定位。定量化细胞骨架：点击 Image → Type → 8-bit 可以二值化图像转换成黑白，分析骨架 An

（1）荧光染料要避光，避免荧光淬灭。（2）在配制 Fluo4-AM 母液时，需要新的无水 DMSO 溶解，因 AM 水解易吸潮，防止其水解，使荧光染料难以进入细胞，影响钙离子探针荧光效果。（3）建议母液现配现用，也可分装保存，但要在 -20℃ 以下密封干燥保存。（4）在处理细胞时要尽量清除培养基残留，避免 AM 基团分解，降低 Fluo4-AM 进入细胞效果，从而减少钙离子探针荧光效果。

1. 将荧光结果图片导入 Image J 软件中；2. 选择 File-open samples-fluorescent cells（400k）；3. 更改通道为「color」，Image-color-channels tool- 将「composite」改为「color」；4. 拆分通道：Image-color-split channels；5. 选中其中一个图片，选择阈值，Image-adju

免疫荧光封片注意事项： 1. 避免气泡，气泡会严重影响封片效果，并使拍照不准确； 2. 封片液不要滴太多，容易使盖玻片滑落； 3. 组化笔画圈不易过小，否则封片剂无法均匀铺展容易采集不到荧光信号。

（1）固定剂的选择：看实验蛋白在细胞哪个位置表达选择相应的固定剂，3.7%-4% 的甲醛或多聚甲醛是常用的固定剂，适用于绝大多数蛋白；（2）通透剂的选择：一般使用 0.1%-0.2% 的 Triton-X100，而选择甲醇固定一般无需再通透，若蛋白不在细胞膜上表达则不需要通透处理；（3）细胞铺板的密度要合适，不要太密（镜下细胞一个连一个不行），也不要太稀（镜下有屈指可数的细胞不行），细胞密度以达到

喉癌细胞系一般均属贴壁细胞。传代的时候，要注意以下事项：（1）细胞消化要适度，如何判断适度？当去除胰酶，轻轻拍打培养皿，可以看到细胞呈泥沙状脱离培养皿底；（2）终止胰酶后，需要离心去上清，去除残余胰酶对细胞的影响；（3）传代时候，需要先在培养皿中加好适量培养基。将细胞沉淀用 1 ml 培养基吹打成单个细胞，动作要轻柔。一般 1:2-1:3 传代，不可过稀；（4）预防细胞污染的关键：增强无菌观念，全

BMDC 的培养注意事项：1. 小鼠品系和性别：目前培养 BMDC 用的比较多的小鼠是雌性或雄性 C57BL/6 小鼠。2. 单独使用 GM-CSF 还是联合使用 IL-4？GM-CSF+IL-4 联合诱导的 BMDC 的成熟度高于 GM-CSF 单独诱导的 BMDC。3. 成熟诱导剂的选择：LPS 和 CD40L 均是 DC 体外完全成熟的强诱导剂，CD40L 诱导成熟的 BMDC 在体内显示出

细胞划痕实验加的无血清培养基里含有生长因子。无血清培养基的成分明确，可以避免血清中的成分不稳定对实验的影响。由于划痕实验检测的是细胞的转移能力，因此需要在无血清培养基里加入细胞生长、迁移所需的生长因子。

首先，全程注意无菌操作；其次，所用器材高压灭菌，试剂若不是无菌则需要 0.22 μm 水系或有机系过滤器进行灭菌；最后，可在培养基中加入 1% 的双抗，防止污染。

看细胞密度及是否污染。若细胞密度不够导致生长缓慢，需要增加细胞接种密度， 或将细胞从大皿转至小皿培养，或试着提高血清浓度；若细胞受轻度污染，则可多加点抗生素。

原代细胞的培养一般需要在培养器皿中预包被一层促贴壁的物质，如 1 型鼠尾胶原，其对细胞及后续提取蛋白没有影响。

看实验目的及实验细胞大小：1、不需要细胞穿过 transwell 小室（研究不涉及细胞运动能力）：如 transwell 小室细胞共培养、Caco-2 Transport 实验及构建细胞极化模型等实验，选择孔径较小的 transwell 小室，如：0.1 μm 孔径多用于药物转到研究，0.4 μm、1 μm 孔径的小室多用于共培养，转运及通透性研究。2、需要细胞穿过 transwell 小室，到达

（1） 打开软件 Image J，在「File」中新建文件「New」，导入要分析的图片；（2）点击「Image」→「Type」→「8-bit」将图片转换成黑白；（3）点击「Edit」→「Invert」将图片背景转换成黑色；（4）点击「Image」→「Adjust」→「Threshold」，选择「B&W」，通过调节滚动条使图片尽可能的包含所有细胞的同时去除背景中的杂质，点击「apply」应用

首先，细胞在离心管中加入适量培养基混匀以充分使细胞团分散，培养基加太多导致细胞团分不散；其次，将吹散的细胞加入器皿时需要用枪轻轻上下混匀；最后，细胞加完需要将器皿轻轻晃动，不要只往一个方向晃动，不要摇动过久。

根据实验目的及实际情况考虑。Transwell 小室内为上室，培养板内为下室，如研究 A 细胞分泌、代谢产生的物质对 B 细胞的影响或趋化作用，上室接种 B 细胞，下室接种 A 细胞。