zhuhuachao 请问各位战友， western-blot法测得的结果是你所要检测蛋白的总蛋白还是只包括游离的蛋白？或者说该目标蛋白与其他蛋白结合以后，western-blot法结果上是否有所反应？ amygdala 一般来说，western blot检测到的是包括游离态和聚合态的总蛋白，目标蛋白与其他蛋白结合的情况下也能检测出来。能否检测取决于抗体的识别位点是否存在，通常情况下目标蛋白的抗体识别位点不会受其形成复合物影响

哈哈,深蒙各位侠士对于兄弟的厚爱和信赖,恐怕我会令大家失望 真正做western我也做的不多,不过由于效果都不是很差,所以就对于整个过程中的某些参数对于结果的影响没有深究,正所谓真正经历实验失败的人才会对具体细节理解深刻一样,但是从关于western方面的文献和资料来看,有关各个参数对于结果的影响是有高质量的paper阐述的,所以大侠们的这些问题和想法个人认为完全是可以做出一篇小论文评述的 这两天刚好有些时间,就把曾经看的资料都大致再看了一下,自己总结了一下,可能仍然对上述大侠

1、试剂耗材的准备：（1）转膜缓冲液（48 mM Tris-HCl，39 mM 甘氨酸，0.037% SDS，20%甲醇）：（2）10 × 丽春红染液：（3）TBS 缓冲液：（4）TBST 缓冲液（含20%Tween20 的TBS 缓冲液）：（5）封闭液（含5%脱脂奶粉的TBST 缓冲液）：（6）一抗、二抗及抗体稀释液：参照说明书，以封闭液或TBST 进行稀释。（7）底物显色液ECL，4℃ 避光保存，现用现配。（8）显影液和定影液用水稀释10 - 20 倍于铝盒中，可多次使用。室温避光存放

相关专题   Western是利用抗体检测蛋白常用的方法，本手册旨在表明Western-blot的技术原理、操作步骤及常见问题 分析，可采用以下步骤进行Western-blot实验： Western-blot技术原理： Western Blot技术是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳后，经PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体 (例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽

相关专题 Western是利用抗体检测蛋白常用的方法，本手册旨在表明Western-blot的技术原理、操作步骤及常见问题分析，可采用以下步骤进行Western-blot实验： Western-blot技术原理： Western Blot技术是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳后，经PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体

哈哈,深蒙各位侠士对于兄弟的厚爱和信赖,恐怕我会令大家失望 真正做western我也做的不多,不过由于效果都不是很差,所以就对于整个过程中的某些参数对于结果的影响没有深究,正所谓真正经历实验失败的人才会对具体细节理解深刻一样,但是从关于western方面的文献和资料来看,有关各个参数对于结果的影响是有高质量的paper阐述的,所以大侠们的这些问题和想法个人认为完全是可以做出一篇小论文评述的 这两天刚好有些时间,就把曾经看的资料都大致再看了一下,自己总结了一下,可能仍然对上述大侠

一、样品制备 1. 变性条件——SDS LB直接裂解 用常温或者高温预热过（预热更有利于阻止蛋白水解或者磷酸酶去磷酸化，但容易遗忘，LB久煮某些性质会改变）的1*SDSLB（或者略高1.5*）直接加 到细胞或者组织上并煮样。通常6孔板细胞80%以上密度，需200ul，其他按平板面积比类推。通常条件下，SDSLB都是过量的（因此不一定要严格参考 SDS LB稀释比）；如果SDSLB不够，样品核酸、蛋白浓度过高时，煮样后会发现tip吸不上来，非常粘、一砣一砣的，很容易堵住tip

lingwu 本人做WB检测加入因子后p-AKT的变化，结果显示 15分钟和30分钟条带叫空白组弱，而到60分钟条带开始增强，6小时达到高峰（较空白组高），这种情况是不是表明因子能够激活p-AKT？是不是一种迟发的激活方式，其上游是不是还有其他的信号转导过程？ zhanghai123 总AKT是否也增高了？ kern6549 建议重复实验，如果确实得到先弱后强的结果。个人认为加入你的

蛋白样品制备 一、实验试剂与器材 1×PBS，细胞裂解液，组织块，上样缓冲液，细胞刮，移液器，EP管，均浆器，离心机，加热器 二、实验步骤 事先准备好碎冰，干净的均浆器插在冰上。准备好各种枪头、移液器、EP管、切组织用的消过毒的手术刀、干净的玻璃板和事先准备好的裂解液（根据需要加入合适浓度的蛋白酶抑制剂） ↓ 迅速取出低温冻存的组织块，各样品切取合适大小使称重尽量一致 ↓ 将组织低温中研碎，然后倒入EP管，加入裂解液冰上裂解。 ↓

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37OC溶解,定容

一、关于CCD相机的另一些指标： 拍摄凝胶的专业CCD相机要用单色的。不能用彩色的。 CCD相机的象素基本上都在一百万多一点。拍摄的照片像素就是1000 X 1000多一点。 好的CCD相机能拍摄12位深度甚至16位深度的灰度图片。这是拍摄弱光样品所必需的。 冷CCD拍摄弱光样品时感光度更高。像化学发光膜这种弱光，最好用低于环境温度20度的冷CCD拍摄。 拍摄凝胶照片有什么技巧？有。 第一个注意事项是要把样品图片拍摄得尽可能大。让样品充满整个画面。样品拍得越

The amount of nitric oxide synthase (NOS) in tissues and cells can readily be determined by Western blotting. Antibodies are now commercially available for the detection of the inducible (i), neuronal (n), and endothelial (e) NOS

试剂配制 （一）母液 1.0mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 30.29g 蒸馏水 200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 PH HCl 7.4 约17ml 7.5 约16m 7.6 约15ml 8.0 约10ml 1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g 异丙醇 100ml 溶解后，分装于1.5ml离心管中，-20℃保存。 0.2mol/L

Western-Blot操作流程 试剂配制 （一）母液 1.0mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 30.29g 蒸馏水 200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 PH HCl 7.4 约17ml 7.5 约16m 7.6 约15ml 8.0 约10ml 1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF 0.174g 异丙醇 100ml 溶解后，分装于1.5ml

（一）母液 1. 1.0mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 30.29g 蒸馏水 200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存

Oxygen radicals are chemical species that have an unpaired electron in their outer orbits. The unpaired electron gives the radical instability and it reacts easily with inorganic or organic chemicals. The three most important species

样品处理及保存（极为重要） 1、悬浮细胞样品：把细胞及培养液一起收集到15ml或者50ml离心管中，1500rpm离心3min，弃去上清；加入10ml 冷PBS轻轻吹打，1500rpm，4℃离心3min，弃去上清；反复2次；第二次弃去上清后，用1ml 冷PBS重悬细胞，移入1.5ml微型离心管，2500rpm（500g），4℃离心5分钟，尽量去除所有残留上清，于-80度或者液氮冻存待用。在避免冻融的情况下，一般保存1年，建议尽快检测。 2、贴壁细胞样品： 2.1 胰酶消化：用胰酶将细胞