western-blot电泳图片光密度分析原理与方法（二）
丁香园
拍摄凝胶的专业CCD相机要用单色的。不能用彩色的。
CCD相机的象素基本上都在一百万多一点。拍摄的照片像素就是1000 X 1000多一点。
好的CCD相机能拍摄12位深度甚至16位深度的灰度图片。这是拍摄弱光样品所必需的。
冷CCD拍摄弱光样品时感光度更高。像化学发光膜这种弱光，最好用低于环境温度20度的冷CCD拍摄。
拍摄凝胶照片有什么技巧？有。
第一个注意事项是要把样品图片拍摄得尽可能大。让样品充满整个画面。样品拍得越大，测量就越准确。
第二个注意事项是要调整好曝光，不要让条带过亮或过暗。曝光过度的条带在光密度分析时肯定是错误的。
第三个刚才已经说了，要保存图片为TIFF格式。不能保存为jpeg格式。在拍摄弱光样品时，还必须保存为12位或者16位灰度的图片，这样的照片能保存肉眼不能分辨的弱光。在分析图片时，能从line profile上能够发现肉眼看不见的条带峰。
图片：当凝胶为竖长条的时候，可以把它横过来拍摄，能拍得大一点。
二、 电脑上的控制与分析程序
到现在才讲到凝胶分析软件了。几乎所有的凝胶分析软件都集成相机控件，可以在程序上直接控制相机。如果是高级点的暗箱，它的照明控制也能集成到软件上。这样拍摄与分析就直接在凝胶分析软件上完成了。
凝胶分析软件最基本的分析功能就是分析电泳条带的位置（可以测量条带分子量）与条带的光密度（可以测量相对的条带质量），叫作“1D-gel分析”。各种不同的软件操作方法不同，但都是在以下面这个程序进行分析：
图片：分析软件上的ＣＣＤ相机控件与镜头控件。
1. 旋转图片rotate image。
大家也许没把这当回事。也许是一般拍摄的照片是正好不需要旋转的。对分析软件来说，电泳图片的方向是有要求的，就是加样孔必须在图片正上方，而且必须保持泳道与条带的方向横平竖直。如果不是，就必须旋转图片调正。
2. 选择泳道位置lanes。
似乎就是用一个矩形框把一个个泳道给框起来。不必全选的，测哪几个泳道就框哪几个。
3. 选择条带位置 bands。
在泳道里再截出一个框把条带给框住。与泳道一样，只需框住需要测量的条带。
在选择泳道与条带时，软件可以自动选择，但是一般情况下，这个功能没用。还是自己手工选择比较方便。
软件大多会有一个line profile图来帮助选择条带范围，这个图上面的曲线表现的是泳道上的光密度分布，一个峰表现的就是一个条带，峰顶是条带位置，条带的范围就是这个峰的两个山脚。会有一对方括号形状来表示条带范围，要用鼠标拖这对方括号到相应的山脚处。
4. 设定扣背景方式 background correction。
这一点绝不能忽略，扣背景方式也有多种选择，选择joining valleys方式是比较好的。如果不扣背景，会导致大得离谱的误差。
注意条带峰的基线下面，其背景值与条带本身的面积差不多大了。对这张照片来说，如果不扣背景，测量的光密度值会增加一倍左右。
5. 设置marker
跑电泳时都要跑个marker的。这个marker实际上就是测量分子量的参照。软件可以利用这个参照来测量各条带的分子量。这个操作会罗索一点。需要作的是：
a. 指定marker泳道。一般会默认第一泳道是marker。但实际跑电泳的时候，把marker放到别的泳道上也许更好。原则是让各样品泳道尽量与marker泳道靠得近点。从这个角度来说，marker放在中间泳道比放在边上更好。
b. 指定marker的分子量序列，就是把marker各条带的分子量一个个输入到程序里。
c. 把marker分子量数值与marker泳道上的条带一一对应起来。
6. 看结果。
这也算是一个操作步骤？算。作好了上面的选择之后，结果就自动计算出来了。但是一个图片的测量数据太多了，以至于很多人看着结果表单不知所措，哪个数据才需要的呢？见过一款软件真的很BT，能显示好几页没用的测量数据。想找到需要的数据挺费事的。
第一个要看的就是各条带的数据在哪个位置。一般的结果表单会把每个泳道的数据排成一列显示，如果要看第三泳道的第二个条带的数据，就在表单的第三列第二行上找数据。
第二个要看的是分子量数据，在表单上会标注为molecular weight 或者M.W.。实际测到的分子量数值不会是完全相同的。一般只要相差不超过3%，就可以认为其属于相同分子量。
第三个要看的是条带的光密度值。这个最罗索。会有一大堆各种各样的数据来迷惑你，让你不知道哪个才是。其实只有一个数据是有用的：IOD。有的软件上用I-vol来表示。其他的统统不必管它。
7. 光密度值是一个相对值，原则上，只有同一张电泳图片上的分子量相同的条带之间才能进行比较。但是分子量不同的条带之间也勉强可以作一个量的比较。
测量到了各条带的分子量与光密度，剩下的就不是图像分析的事情了。自己把数据抄到excel里去作柱状图。或者作统计计算。
大家可能注意到我没提光密度校正。是的，不是没作，而是程序已经自动作了。在你选择条带的时候，程序会自动选择相应的光密度较正方式。所以我们就不需要操心这个了。需要注意的是，所有的电泳图片能分成两类，一类是黑色背景，亮条带。另一类是白色背景，暗条带。一般程序会自动识别这两种类型，自动作好光密度校正。不过有时候图片不典型，也会让程序糊涂起来。程序弄错的时候，会表现在line profile上，你会发现上面的峰颠倒过来了。这时候就得找相应的设置。一个是指定一下分析任务，在DNA与protein之间正确地选择一个。另一个是在条带选择窗口里找“bright background, dark band”及“dark background, bright band”，在这两者之间选择一个正确的。
我这里使用的是gel-pro程序的界面以及UVP的凝胶成像系统。本讲座的重点并不在于具体如何操作软件，而是讲解为什么要作这的操作。关于这个软件的操作另有详细的操作演示。其他的设备及软件使用方法在原理上是一样的。操作方法就得自己去学了。
图片：选错了条带亮暗的类型后，line profile曲线上的峰倒过来了。
to be continue ...更多有关el-pro相关的文件，包括操作指导powerpoint演示，屏幕录像演示，还有其他一些可能有用的文件。q请见下一期
感谢战友：hbchendl；原文来源于丁香园论坛：http://www.dxy.cn/bbs/topic/14545324?keywords=%E6%95%AC%E8%AF%B7%E5%85%B3%E6%B3%A8%E7%94%B5%E6%B3%B3%E5%9B%BE%E7%89%87%E5%85%89%E5%AF%86%E5%BA%A6%E5%88%86%E6%9E%90%E5%8E%9F%E7%90%86%E4%B8%8E%E6%96%B9%E6%B3%95
