基因芯片实验原理与方法（二）

1、分别加入1/10体积3mol/l NaAc（pH4.5）和等体积5:1酸性酚氯仿溶液，冰浴20min 4℃，1100undefinedg，20min离心。

2、吸取上清至一50ml离心管，加入等体积异丙醇，混匀后-20℃放1小时。

4、 4℃，110undefinedg，20min离心，弃上清。

5、每管加入3毫升的溶液D,溶解沉淀,再用等体积的酚氯仿各抽提一次。

6、加等体积的异丙醇，-20℃沉淀2小时。4℃，1000undefinedg离心20min，弃上清。

7、加入10ml冰预冷的75%乙醇,洗涤沉淀2次，晾干沉淀。

8、溶解和比色

8.1、按照0.5ml/g组织的比例加入Milli-Q水200ml，彻底溶解沉淀。

8.2、取适量的样品用10mol/ml的Tris稀释一定倍数,测分光光度值。一般来说ratio（260与280的比值加320系数）值，在1.80—2.00之间比较好。

8.3、配1.0% 的胶，取500ng样品走电泳鉴定。

（一)mRNA的分离与纯化

1、称取一定量的oligo（dT）-纤维素，悬浮于1×上样缓冲液中。

2、将悬浮液装入填有经DEPC处理并高压灭菌的玻璃棉的1ml玻璃注射器中，柱床体积0.5-1ml，用10mlDEPC处理的水冲洗。柱床体积为1ml的oligo（dT）-纤维最大载样量为10mg总RNA，如总RNA的量较少，则应减少柱床体积。

3、用5倍体积的0.1mol/L的NaOH洗柱，然后再用5倍体积的ddH2O冲洗柱子。

4、用10倍床体积的洗脱缓冲液平衡柱子。

5、用10倍床体积的上样缓冲液平衡柱子，备用。

6、用ddH2O溶解RNA样品，68℃水浴3min后迅速插入冰浴中，加等体积的2×上样缓冲液，上样，然后收集流出液。

7、当全部溶液快流干时，将流出液置于68℃水浴3min后，迅速冷至室温后重新上样，并收集流出液。

8、用大量的1×上样缓冲液洗柱，直至OD260值很低或为零。

9、待上样缓冲液快流干时，加洗脱缓冲液洗柱，用1.5ml离心管分管收集，每管约400ul，共收集6管，通常mRNA洗脱峰集中在第2管中，第3管次之，第4管后就很少，而第1管中几乎没有RNA洗脱下来。

10、用分光光度计测OD260值，合并mRNA的洗脱组份。加入1/10 3mol/l NaAc（pH5.2）和3倍体积无水乙醇，混合后-80℃保存备用。

11、用时取出，4℃，12000r/min离心20min，弃上清，70%乙醇洗涤2次，沉淀中温烘干，备用。