联合应用流式细胞术和基因芯片方法检测转录谱

流式细胞和基因表达谱两项技术具有很多共同特征：涉及复杂的高精尖设备；能够提供方法分析那些独特的、常规手段不易获得的细胞；需要大量的数据分析和归档功能。但是，在一个特殊的、重要的概念上它们也有所不同：当细胞混合在一起时，流式细胞术（细胞分选技术与其相似）通过分析细胞的光学特性，将它们分成同质的细胞群，留待进一步研究，从而降低了细胞混合物的复杂性。而全基因表达谱技术则提供了某一个特定生物标本内所有基因的信息，通过其非常复杂的方式获取信息，因此只能通过数据处理的方法简化。如果将这两种技术结合起来，根据细胞种类的不同设计出特殊的标记方法，就能够分离组织，分选足够的细胞以便随后分析全基因谱表达，原则上就可能鉴定任何特定类型细胞内的全基因谱表达模式。

联合应用流式细胞术和基因芯片方法检测转录谱的原理是将流式细胞和基因表达谱两项技术结合起来，根据细胞种类的不同设计出特殊的标记方法，就能够分离组织，分选足够的细胞以便随后分析全基因谱表达，原则上就可能鉴定任何特定类型细胞内的全基因谱表达模式。

器材：

① 基因芯片板：SuperAmine SMM（TeleChem International，Inc.，桑尼维尔，加州）；

② 基因芯片点样针：SMP3（TeleChem）；

③ 基因芯片点样机：装备有 Stealth 点样头 SPH48（TeleChem）的 An OmniGrid 100（GeneMachines，圣卡洛斯）；

④ 384 孔板（Genetix，New Milton，England，cat. 型号 X7001）；

⑤ Oligo（dT）₂₅ Dynabeads（目录号 610.05）和 1.7 ml 磁性颗粒浓缩器（MPC）（目录号 120.20）（均购自奥斯路，挪威）；

⑥ 无核酸酶的 1.7 ml 离心管（Life Science Products Inc.，Denver 公司，目录号 7 509-2 002）；

⑦ Microcon 柱（Millipore，比尔里卡，马萨诸塞州，目录号 YM30）；

⑧ 盖玻片：24 mm × 60 mm，Hybri-Slips（Sigma，圣路易斯，密苏里州，目录号 H-0 784）。

试剂：

① 结合缓冲液：1 M LiCl，2 mM EDTA，20 mMTris-HCI，pH7.5，用不含 RNA 酶的水配成总体积 50 ml；

② 洗涤缓冲液：0.15 mM LiCl，10 mM Tris-HCl，pH7.5，用不含 RNA 酶的水配成总体积 50 ml；

③ 洗脱缓冲液：10 mM Tris-HCl，pH7.5，用不含 RNA 酶的水配成总体积 15 ml；

④ 再生缓冲液：0.1M NaOH；

⑤ 储存缓冲液：250 mM Tris-HCI，pH7.5，20 mM EDTA，0.1％ Tween-20 和 0.02％ 叠氮化纳；

⑥ 液体阻断剂（Amersham Biosciences，皮斯卡塔韦，新泽西州，目录号 RPN3 601）；

⑦ Cy3-和 Cy5-dUTP（Amersham Biosciences，cat. 型号 PA53 022 和 PA55 022）；

⑧ PowerScript 逆转录酶（BD Biosciences Clontech，帕洛阿尔托，加州，目录号 8460-1，8 460-2）；

⑨ Trizol（Invitrogen，卡尔斯巴德，加州，目录号 15596-026）；

⑩ RNA 酶抑制剂（Invitrogen，目录号 15 518-0 120）。

引物：随机的 15-mer 引物（Qiagen-Operon，目录号 SP180-1，SP180-2）；随机的六聚物引物（Invitrogen，目录号 48-190-011）

联合应用流式细胞术和基因芯片方法检测转录谱的基本过程可分为如下几步：

1、拟南芥寡核苷酸基因芯片的点样

1.1 准备寡核苷酸点样

1.1.1 在含有 600 pmol 寡核苷酸的 384 微孔板中，每孔加入 15 μl 无菌蒸馏水（dH20）。

1.1.2 在配有 384 微孔板离心吊篮的 Sorvall 5B 离心机（Kendro 实验室产品，阿什维尔，北卡罗莱纳州）中，200 g 快速离心微孔板（1 000 rpm，用 SH 3 000 转子）。

1.1.3 转入定轨振荡器（如 Stovall Life Science 的 Belly Dancer，格林斯博罗，北卡罗莱纳州）中，室温下振荡 1 h。

1.1.4 用 12 道微量加样器在孔内重悬几次混匀溶液，移出 7.5 μl 到一新的 384 微孔板中。

1.1.5 在 SpeedVac（Savant Instruments，霍尔布鲁克，纽约州）中，调至 50 ℃，干燥微孔板。

1.1.6 将一组微孔板置于 - 20 ℃ 保存。将第一组微孔板点样（从 300 pm 的量约可点 750 个微陈列），然后再进行第二组点样。

1.2 寡核苷酸微阵列的再水化和点样。

1.2.1 每孔加入 8μl 的 3 × 枸橼酸钠盐（SSC）。

1.2.2 室温下放置定轨摇床上 1 h。寡核苷酸现在准备完毕，可以点样。

1.2.3 用 TeleChem SMP3 型点样针，将拟南芥寡核苷酸基因芯片点在氨基甲硅烷涂渍的 SuperAmine 玻片上。

1.2.4 该芯片以每 100 阵列为一个单元（无重数点），每个单元中心间距为 160 μm 进行点样，点样头使用 48 针，相对湿度 31％，每 50 个玻片后再次浸蘸。点样头的速度设置为最大 10 mm/s。

1.2.5 80 ℃ 放置 1 h，烘干玻片。室温下避光干燥保存。

1.2.6 点样后用 Speed Vac 干燥微孔板。随后的点样，我们用 10-（N/2）μl 去离子水（diH20）重悬样品，这里 N 是指点样阵列的次数。

1.3 固定寡核苷酸阵列单元。

1.1 再水化基因芯片玻片，即置于 50 ℃ 以上的水中 5~10 s；然后立即在 65 ℃ 的加热块上放 5 s 干燥。重复这一步骤 3 次或 4 次。

1.2 通过 UV 交连玻片，DNA 面向上以 65 mJ/c㎡ 经 UV 交连（如，Strata 基因公司的 Strata 交连剂，拉霍尔，加州）最大可使用 130 mJ/c㎡ 进行交连。

1.3 室温下在 1％ 的十二烷基硫酸钠溶液（SDS）中洗玻片 5 min。

1.4 在 100％ 乙醇中浸泡基因芯片 30 s，轻轻摇动，以除去 SDS。

1.5 在 Sorvall 离心机中 200 g（用 SH 3 000 转子，1 000 rpm）离心 2 min，甩干玻片。

1.6 室温下将玻片保存在干燥、避光的盒子中。

2、拟南芥寡核苷酸基因芯片杂交

2.1 制备 RNA

2.1.1 制备总的 RNA

（1）戴上手套！RNA 特别不稳定，由于普遍存在的核糖核酸酶很容易发生污染。所有的水溶液均应用二乙基焦碳酸酯（DEPC）处理的去离子水制备。玻璃仪器应高压灭菌。

（2）冷冻研钵，包括研棒加入大约 100 ml 液氮。在液氮蒸发一半时加入 200 mg 组织。

（3）用研棒迅速研碎组织，注意避免丢失样本。液氮完全蒸发时加快研磨速度，直至出现滑石粉样的细小粉末。

（4）每 100 mg 组织加 1 ml Trizol，继续用研棒研磨。如果液体混合物冻结，稍等让其轻微融化，然后继续研磨。

（5）完全混匀时，让浆状物融解（等待时用铝箔盖住研钵），用 Eppendorf 移液器将 1 ml 浆状物转至 1.5 ml 无 RNA 酶的试管中。

（6）室温下孵育 5 min。

（7）每 1 ml 体积的 Trizol 加入 0.2 ml 氯仿，混旋 15 s。

（8）室温下孵育 1 min。

（9）4 ℃，15 300 g 离心 10 min。

（10）将上清液转至一新的无 RNA 酶的试管中，立刻放于冰上。在转管过程中，用移液器从最上端和试管边缘移去水相，底层（有机层）之上缓冲带保存完好。

（11）加入等量的异丙醇沉淀。倒置试管 2 次，混匀，冰上孵育 15~30 min。

（12）4 ℃，15 000 g 离心 10 min 后，可见小白片状沉淀物（沉淀物的大小取决于原材料的数量，但我们用的是 200 mg 组织，应该看到沉淀物）。偶尔，沉淀物可能是紫色或棕色，这取决于使用的原材料组织类型或植物生长的条件。

（13）倾倒上清液。在微型离心机内快速离心 1 min，用 200 μl 的 Eppendorf 移液器弃去残留的上清液。

（14）加 1.0 ml 用无 RNA 酶（DEPC 处理过的）水配制的 75％ 乙醇洗沉淀物，要小心，因为沉淀物可能会变松散。用移液器弃去大部分的乙醇。

（15）室温下将试管倒置在 Kimwipe 吸水纸上，空气干燥沉淀物 5 min（不要干燥时间过长，因为沉淀物将难以重悬）。

（16）加入 25 μl 的无 RNA 酶水，用 200 μl 的 Eppendorf 移液器重悬（打散沉淀物以助其溶解）。冰上孵育至少 1 h，期间间或用移液器重悬。用在 TBE（Tris-硼酸盐-EDTA）缓冲液中制备的 1％ 琼脂糖凝胶快速检测 RNA 的特性（这种常规程序的细节见参考文献 46）。

（17）4 ℃，20 000 g 离心已溶解的 RNA 15 min。

（18）将上清液转至一新的无 RNA 酶的试管中。注意：上清液和它下面不需要的碎片层的并不是总能明显区分的。

（19）（可选步骤）只是对那些「难处理」的组织才有必要进行重复沉淀（玉米胚乳需沉淀 3 次，根部组织则重复 1 次）。加 10％ 体积的 3M 醋酸钠和等量体积的 100％ 异丙醇重复沉淀。沉淀物置于冰上 1 h（或 - 80 ℃ 过夜）。

（20）4 ℃，20 000 g 离心 20 min。

（21）放置冰上，在 25 μl 无 RNA 酶的水中溶解 1 h，重悬。

（22）4 ℃，20 000 g 离心 20 min。

（23）分光光度计测定 RNA 浓度。如浓度＜100 ng/μl，则重复异丙醇沉淀。

（24）在 1 × TBE（Tris-硼酸盐-EDTA）缓冲液中制备的 1％ 琼脂糖凝胶上跑电泳，检测 RNA 的完整性。

（25）- 80 ℃ 保存剩余的 RNA。

2.1.2 用 Dynabeads 从总 RNA 中制备多聚 A⁺ RNA

（1）摇匀 Dynabeads（Dynabeads 是棕色的），将 200 μl（是总 RNA 体积的 2 倍）混悬液移至无核酸酶的 1.7 ml 试管中。

（2）将试管放置在 Dynal MPC 磁体上 1 min。检查磁珠和溶液是否明显分离，用移液器从试管中弃去储存缓冲液，不要破坏沉淀物。

（3）从 MPC 上取下试管，在 200 μl 结合缓冲液中重悬磁珠，用移液器混匀。

（4）重复第 2 步和第 3 步，现在可以使用 Dynabeads 了。

（5）用 100 μl DEPC 处理过的无菌水将 75 μg 总 RNA 转至无核酸酶的 1.7 ml 试管中，加入 100 μl 的 2 × 结合缓冲液。

（6）65 ℃ 孵育 RNA 2 min，然后加入结合缓冲液/Dynabeads 混悬液。

（7）用移液器混匀，室温下轻轻颠倒试管，退火 3~5 min。

（8）将试管放置在 MPC 磁体上 30s 或直至混悬液澄清，用 Eppendorf 移液器弃去上清液。

（9）将试管从 MPC 磁体上取下，用 200 μl 清洗缓冲液洗磁珠 2 次，在弃去上清液之前每次均用 MPC 磁体浓集磁珠。

（10）加入 10 μl 洗脱缓冲液，80 ℃ 孵育 2 min，从 Dynabeads 上洗脱 mRNA。立即将试管放置在 MPC 磁体上，迅速将上清液转至无菌的 1.5 ml 试管中，不要破坏沉淀物。如果洗脱的 mRNA 不立即使用，则 - 70 ℃ 保存。

（11）pH8.0 TE（Tris-EDTA）作为缓冲液，用分光光度计在 260/280 nm 波长定量测定 RNA。A₂₆₀/A₂₈₀ 比率为 1.8~2.0 表明制备的 poly（A）+ RNA 很纯。poly（A）⁺ RNA 的产量应该是总 RNA 的 2％~3％。

（12）Dynabeads 最多可使用 4 次，加入 150 μl 重建缓冲液可再生 Dynabeads，用移液器充分混匀。

（13）65 ℃ 孵育试管 2 min。

（14）将试管放置在 MPC 磁体上，澄清时弃去液体。

（15）将试管从 MPC 磁体上取下，加入 200 μl 重建缓冲液，用移液器充分混匀。

（16）将试管放置在 MPC 磁体上，弃去所有液体。

（17）取下试管，加入 200 μl 储存缓冲液。

（18）将试管放置在 MPC 磁体上，澄清时弃去缓冲液。

（19）现在可以重复使用 Dynabeads 了，从第 5 步开始。

2.2 标记 RNA，以备寡核苷酸基因芯片杂交

2.2.1 来自总 RNA 的荧光靶产物

（1）在 2 个 0.5 ml 试管中分别标记「Cy3」和「Cy5」，用铝箔盖住试管以避光（染料对光敏感）。用一对 Cy3 和 Cy5-标记的 RNA 靶序列进行杂交，这两种 RNA 靶序列分别制备，杂交前混合。始终将 RNA 置于冰上，除非特别指出。

（2）在 2 个 0.5 ml 试管中将下列物质混合：20~50 μg RNA 直到 20.0 μl，2.0 μl dNTP（10 mM dATP，dCTP，dGTP，2 mM dTTP），2.0 μl Cy3 或 Cy5-dUTP（1 mM）和 2.0 μl oligo-dT 引物 (0.5 μg/μl)。

（3）在 65 ℃ 水浴箱孵育混合物 5 min。

（4）加入：8.0 μl 5 × 第一链缓冲液，4.0 μl 0.1 M DTT，1.0 μl RNA 酶抑制剂（10 U/μl），和 1.0 μl PowerScript RT，补充到 40.0 μl，以加热混合物。

（5）42 ℃ 孵育试管 2 h，通过程序设计 PCR 仪，此步骤操作很方便。

（6）加入 5 μl 0.5 M EDTA 和 5 μl 1 N NaOH，在 65 ℃ 水浴箱孵育 10 min。

（7）加入 25 μl pH8.0 的 1M Tris-HCl 和 100 μl TE。冰上储存或在 - 20 ℃ 冰箱冷冻过夜，直至准备提纯。保证试管完全包裹在铝箔里。

2.2.2 来自多聚 A⁺ RNA 的荧光靶产物

（1）在 2 个 0.5 ml 试管中分别标记「Cy3」和「Cy5」，用铝箔盖住试管以避光（染料对光敏感）。用一对 Cy3 和 Cy5-标记的 RNA 靶进行每一个杂交，两种标记的 RNA 靶序列分别制备，杂交前混合。始终将 RNA 置于冰上，除非特别指出。

（2）在每个 0.5 ml 试管中将下列物质混合：

1~2 μg poly（A）^＋ RNA 直到 20.0 μl，2.0 μl dNTP（10 mM dATP，dCTP，dGTP，2 mM dTTP），2.0 μl 1 mM Cy3 或 Cy5-dUTP 和 1.0 μl 3 μg/μl 随机六聚体引物。

（3）在 65 ℃ 水浴箱孵育混合物 5 min 后，冰上冷冻 5 min。

（4）加入：8.0 μl 5 × 第一链缓冲液，4.0 μl 0.1 M DTT，1.0 μl RNA 酶抑制剂（10 U/μl），和 2.0 μl PowerScript RT，补充到 40.0 μl，以加热混合物。

（5）室温下孵育试管 20 min，然后 42 ℃ 孵育试管 2 h（此步骤应用 PCR 仪操作）。

（6）加入 5 μl 0.5 M EDTA 和 5 μl 1 N NaOH，在 65 ℃ 水浴箱孵育 10 min。

（7）加入 25 μl pH8.0 的 1 M Tris-HCI 和 100 μl TE。冰上储存或在 - 20 ℃ 冰箱冷冻过夜，直至准备提纯。保证试管完全包裹在铝箔里。

2.3 靶序列的提纯

靶序列的提纯是基于体积排阻法，用 Microcon YM30 柱中的硝基纤维滤膜进行的。这些滤膜阻止了大于 55 bp 的单链 DNA 分子和其他摩尔分子量＞30 000 的分子。

2.1 记下每一对柱和试管及其相对应的准备提纯、且已标记的靶序列的标记。

2.2 用 200 μl 的 Eppendorf 移液器将已标记的靶转序列至离心柱中，不要碰到膜。

2.3 15 ℃，11 700 g 离心 15 min（确保柱中没有残留液体）。

2.4 每个柱中加 100 μl TE。用移液器混合溶液，当心不要损伤膜。防止柱流出溶液，以防膜破裂。

2.5 15 ℃，11 700 g 离心柱 15 min。

2.6 重复 TE 洗（第 4~6 步）总共 4 次。

2.7 洗 4 次后，最后加 40μlTE 到柱中，离心。用 Eppendorf 移液器小心混合。

2.8 室温下放置 2 min。

2.9 上下颠倒柱子，放入 1 个新的离心管。15 ℃，11 700 g 离心 1 min。

2.10 立即用标记好的靶序列杂交，或盖上铝箔，放置 -20 ℃ 冰箱储存。

2.4 基因芯片杂交

用配对的 Cy3 和 Cy5-标记的靶序列进行杂交。

2.4.1 在离心管中混合下列试剂：25.0 μl 20 × SSC，16.0 μl 液体阻断剂，10.0 μl 2％ SDS，X μl 标记的靶，和 diH₂O，加至 250 μl。

2.4.2 将离心管放置沸水中 2 min，使标记的靶序列变性。迅速把试管放于冰上。

2.4.3 将基因芯片玻片（有 DNA 的面朝上）放置 65 ℃ 加热块上，滴加标记的靶序列并用 24 mm × 60 mm Hybri-Slip 塑料盖上，避免产生气泡。建议配置突起的盖玻片

2.4.4 在 65 ℃、潮湿的小室里孵育玻片 8~12 h。按照下述方法用一次性有盖（Petri）培养皿即可构建一个简单的湿度小室：

（1）把 100 mm × 15 mm 的方形 Petri 培养皿的下面部分颠倒过来，放在 150 mm × 15 mm 的大而圆形 Petri 培养皿（VWR International，目录号 25 384-139）内。

（2）在圆形的 Petri 培养皿中加 5 ml 蒸馏水。

（3）然后把整个培养皿放进 65 ℃ 烤箱，平衡 1~2 h。

（4）把基因芯片玻片放在方形的 Petri 培养皿上方，盖上圆形 Petri 培养皿的盖子。在 www.ag.arizona.edu/microarray 网站上有这种方法的例子。

2.4.5 55 ℃，在 2 × SSC ＋ 0.5％ SDS 中洗玻片 5 min，室温下 0.5 × SSC 中洗 5 min，室温下 0.05 × SSC 中洗 5 min。

2.4.6 在 Sorvall 离心机内以 200 g（1 000 rpm，在 Sorvall SH 3 000 转子中）甩干玻片。根据厂家的建议立即用基因芯片扫描记录仪扫描玻片。