电泳图片光密度分析原理与方法（一）

无论是DNA电泳图片还是RNA电泳图片，或者是蛋白的凝胶电泳图片包括Western blot膜、或者是化学发光膜图片，在图像分析的角度来看，都是同样的一种条带光密度分析的问题。

分析电泳条带有专门的一类图像分析软件。常见的是Bandscan, Quantity One, 由各个凝胶电泳成像系统厂商自己编制的软件就更多了。我喜欢用的是Labworks, 是UVP公司生产的凝胶电泳成像系统上配用的拍摄与分析软件，实际上就是传说中大名鼎鼎的gel-pro。这个软件可以看作是Image-pro plus应用在电泳条带分析上的专业版。所以用惯了IPP后对gel-pro就会感觉很熟悉。很快就能学会使用。现在UVP已经不使用labworks了，另弄了一个visionworks软件，用起来就是没gel-pro舒服。实际上所有的电泳条带分析软件在分析原理与功能上都没什么差别。只是软件界面与操作程序上各有不同。所以，了解了条带的分析原理后也就能自己学会各种软件的使用了。

分析电泳条带也是从拍摄电泳照片开始的。用平时玩的数码相机拍摄的电泳条带一般不能用来进行定量的分析。而必须使用专门的拍摄设备。大家一般称它为“凝胶成像系统”。它集中了观察，拍摄与分析凝胶的所有功能。

一个凝胶成像系统包括了三个部分，暗箱，相机与电脑上的控制分析程序。让我们从使用成像系统的操作方法中来了解如何正确地拍摄与分析凝胶吧。

一、  暗箱

一个最简单的暗箱就是个不透光的箱子里面放了一个紫外灯箱，高级一点的暗箱则有好几组灯光照明。当然，在箱子上面会有一个安放相机的地方。

紫外灯箱是观察与拍摄凝胶的必需照明设备。它是用来观察EB染色的凝胶条带的。里面的紫外灯光能提供256nm,302nm及365nm的紫外光。在观察EB的红色荧光条带时，一般用302nm。

在观察与拍摄蛋白凝胶的时候，必须使用透射白光照明。有的暗箱里会有白板照明灯，平时向上掀起靠在后壁上，使用时拉下来。简单的暗箱则是用一块荧光板放在紫外灯箱上面，用紫外光照射荧光板，发出白色光。用白板的透射光照明来拍摄蛋白凝胶的道理有点像医院里用灯箱来观察X光片。只有在透射光下，才能正确地反映凝胶上条带的光密度分布。

暗箱上面也有白光照明与紫外光照明。这是用来拍摄普通样品的灯光。比如拍摄Western blot膜。

实际上一个照明配置完整的暗箱绝不仅仅是用来拍摄凝胶的。它可以拍摄多种小的实验样品，如组织与器官等。

图片：透射光下拍摄的蛋白凝胶图片条带层次很丰富的。普通照明下是没这个效果的。

二、  相机与镜头系统。

凝胶成象系统使用的是单色数码相机，这是分析凝胶光密度的要求。使用单色相机的优点在于其感光度高。这对于拍摄强度很弱的荧光凝胶或化学发光膜都是必需的。数码相机从普通到高级的都有。最基本的应该配置一台冷CCD数码相机。要拍摄化学发光膜的话，最好是配置致冷温度能达到低于环境20-30度的冷CCD相机。与使用胶片曝光相比，用冷CCD拍摄化学发光的WB膜不仅仅是方便，而且具有更好的图片效果。而且能准确地控制曝光。

左图是普通照明下的膜片，右图是化学发光图像。一般来说，图片能拍摄得比压片干净漂亮而且能控制曝光正确。注意到图片上有一个个细小的亮点吗？这叫热噪声点。CCD的致冷温度越低。这种热噪声点就越少。这张图片是低于环境温度10度的冷CCD相机拍摄的。如果是普通相机，画幅上的样品会被热噪声点给淹没的。拿自己的数码相机在黑暗处不用闪光灯照点啥就能体会到了。

在拍摄弱光样品时，要使用相机拍摄12位灰度甚至16位灰度的单色图片。这样能使得照片上暗光部分有充足的细节表现。这样才不辜负价格昂贵的冷CCD相 机。这种照片文件会很大，而且只在专业的图片软件上才能显示，在电脑的普通程序上需要经过转换才能显示。但它对于分析电泳条带是非常有利的。

拍摄弱光样品时采用的是积分曝光方式，不停地拍摄，不停地显示，直到曝光满意为止。所以肯定能得到一张满意的照片。

镜头系统也是凝胶成像系统的一个重要部分。它与普通的照相机变焦镜头功能相同，不过是对焦距，变焦放大缩小，还可以调整光圈。但不一样的是，它是一个近摄镜头，放大倍数在0.1倍到4倍之间。正好填补了显微镜与日常用数码相机的放大倍数之间的空缺。所以有时候制作的大体切片，在显微镜上不能完整拍摄的时候，也可以放到这里拍摄。

在拍摄荧光样品时，必须使用滤光片来过滤掉激发光。最常见的就是在拍摄EB染色的凝胶时必须使用红色滤光片。

左图：普通相机未加滤光片拍摄的凝胶照片。右图：用冷CCD拍摄的凝胶照片。

未完待续。。。敬请关注电泳图片光密度分析原理与方法（二）