Western-blot实验操作手册

互联网2013-09-06

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Western是利用抗体检测蛋白常用的方法，本手册旨在表明Western-blot的技术原理、操作步骤及常见问题分析，可采用以下步骤进行Western-blot实验：

Western-blot技术原理：

Western Blot技术是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳后，经PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

实验步骤：

Western，也称western blot 、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。

1. 收集蛋白样品(Protein sample preparation)：

使用适当的裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。

亚细胞组分分离方法：(参考)

制备组织匀浆(根据组织类型选择不同的匀浆方法，进行优化)

离心时间亚细胞组分

1,000g X 10 min pellets nuclei(细胞核)

heavy mitochondria(线立体)

plasma membrane sheets(浆膜)

3,000g X 10 min heavy mitochondria(线立体)

plasma membrane fragments(浆膜)

6,000g X 10 min Mitochondria(线立体)

Lysosomes(溶酶体)

Peroxisomes(过氧化物酶体)

intact Golgi(完整高尔基体)

10,000g X 10 min Mitochondria(线立体)

Lysosomes(溶酶体)

Peroxisomes(过氧化物酶体)

intact Golgi membranes(完整高尔基体膜)

20,000g X 10 min Lysosomes(溶酶体)

Peroxisomes(过氧化物酶体)

Golgi membranes(高尔基体膜)

large dense vesicles(大高密度囊泡)

100,000g X 10 min all vesicles from ER(来自内质望网的囊泡)

plasma membrane(浆膜)

Golgi(高尔基体)

Endosomes(内含体)

注：以上方法仅做为参考，需根据实验条件进行优化。

收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。

2. 电泳(Electrophoresis)：

(1) SDS-PAGE凝胶配制(参考一些文献资料进行配制)

(2) 样品处理

在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白。

(3) 上样与电泳

冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小。

为了电泳方便起见，也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式，通常把电压设置在100V，然后设定定时时间为90-120分钟。设置定时可以避免经常发生的电泳过头。

通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。

3. 转膜(Transfer)：

(1)膜的选择：推荐在Western实验中选用PVDF膜。

硝酸纤维素膜(NC膜)也可以使用，但硝酸纤维素膜比较水浴加热3-5分钟，以充脆，在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。

膜的使用请参考生产商的推荐使用步骤。

(2) 分变性蛋白

电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。对于Bio-Rad的标准电泳装置或类似电泳装置，低电压可以设置在80-100V，高电压可以设置在120V左右。S

DS-PAGE可以采用普通的电泳仪就可以满足要求，通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，可以设定转膜电流为300-400mA，

(3) 转膜时间

转膜时间为30-60分钟。也可以在15-20mA转膜过夜。

具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定，目的蛋白的分子量越大，需要的转膜时间越长，目的蛋白的分子量越小，需要的转膜时间越短。

在转膜过程中，特别是高电流快速转膜时，通常会有非常严重的发热现象，最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。

转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。

转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。

4. 封闭(Blocking)：

转膜完毕后，立即把蛋白膜放置到预先准备好的Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，以洗去膜上的转膜液。吸尽洗涤液，加入Western封闭液，在摇床上缓慢摇动,室温封闭60分钟。

从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。

对于一些背景较高的抗体，可以4℃封闭过夜。

5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)：

参考一抗的说明书，按照适当比例用稀释一抗。

吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。或更据抗体的说明选择适当的孵育温度和时间。

回收一抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

注：Western结果通常需要提供内参作为对照，通常可以选用Tubulin抗体或Actin抗体，进行内参检测。

6. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)：

吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。

回收二抗。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液洗涤5-10分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。

参考二抗的说明书，按照适当比例稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。

二抗需根据一抗进行选择，例如，一抗是小鼠来源的IgG，则二抗需选择抗小鼠IgG的二抗，如辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)。

7. 蛋白检测(Detection of proteins)：

参考相关说明书，使用ECL类试剂来检测蛋白。

压片可以采用专用的压片暗盒进行。

洗片时可以使用X光片自动洗片机。如果没有自动洗片机，可以用显影定影试剂盒自行配制显影液和定影液进行手工洗片。

8.Western Blot问题解答：

无显色信号问题的原因分析：

1.裂解产物中抗原含量不足

a. 抗原无表达或表达量过少

b. 蛋白降解或上样量不足

c. 裂解产物制备失误

2.制胶浓度比例不合适。

3.转膜不完全

4.一抗稀释浓度过大

5.二抗与一抗不匹配

6.显色系统灵敏度不足

非特意性杂带出现的原因分析：

1.封闭或清洗不彻底

2.一抗浓度过高

3.蛋白降解

4.抗体与非特异性蛋白交叉反应

5.蛋白间聚集作用，形成二具体

6.转移膜使用不当

7.操作过程中转移膜干燥