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玻璃奶可用于回收DNA，本办法有多种用处，次要包括：从琼脂糖凝胶中别离纯化DNA片段；从DNA反响物中纯化目的DNA片段，如回收纯化PCR产物、酶切衔接反响中的DNA片段；从探针制备反响物中去除未标志上的核苷酸以及小的DNA片段（比方引物）；DNA稀释、去盐及去除杂质。这就需要玻璃奶是更微小的玻璃颗粒，在溶液中不会很快沉淀，容易悬浮在液体中用来吸附核酸。

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PCR 产物的 TA 克隆

TA克隆系统可以用于快速地、一步到位地把PCR 产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。

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PCR产物的TA克隆

PCR产物克隆大致分为两类，即平头连接和粘头连接。平头连接是将制备好的平头载体和补平或削平的PCR 产物直接进行连接。载体可用EcoR V或Sma I切成平头；PCR 产物纯化后，可以在22℃用DNA聚合酶I作用30min（利用该酶所具有的3’→5’外切酶活性和5’→3’的聚合酶活性）。如果要求不高，PCR 产物也可不加处理。如果使用Stratagene公司的pfu DNA聚合酶或New England Biolabs公司的Vent DNA聚合酶，这两种酶有5’→3’校对能力，扩增出来的PCR 产物已经是平头，可以不作平端处理。平端连接的一个显而易见的缺陷是连接效率低下，即使使用很高单位的连接酶，或在反应体系中加入PEG 8000，也只能很有限地提高效率。粘头连接也可以大致分为两类，一类粘头连接是用某种方法，在载体和PCR 产物上产生长的可互补的粘性末端。最普遍的方法是在引物的5’端加入一段某种限制酶的识别序列。如果两个引物选用不同的限制性内切酶识别序列，就可以做到定向连接。另一类利用部分PCR 产物3’端带有一个凸出的dAMP的特性，构建3’端带有凸出的dTMP的载体。一般采用的方法是先把载体用某种限制性内切酶消化成平头，在70℃或72℃下在只加入一种dNTP、即dTTP的反应体系中用Taq DNA聚合酶处理半小时（也有人报道处理1～2小时能提高克隆效率，这样加T反应会更彻底）。也可以用末端转移酶来完成加T反应。载体自连、PCR 产物串连可以忽略。如果使用ddTTP，效果会更好。这种方法一般称为加T/A法克隆，比平头连接效率高50～100倍。

操作方法所属实验：PCR 产物的 TA 克隆

PCR产物的平末端克隆

靶基因经 PCR 扩增，样品进行必要的纯化回收后，接下来用平末端进行连接克隆也是分子生物学实验中常规采用的技术路线，实验一般利用噬菌体 T4 DNA 聚合酶等补平扩增 DNA 片段的末端（Weiner 1993; Chuang et al. 1995)。Liu 与 Schwartz (1992) 发现在连接反应的温育过程中，当反应液中存在过量的限制性内切核酸酶能显著地增加重组质粒的产率。这种内切核酸酶的作用在于切割环状的和线性的串联体，而这种内部的酶切位点是由质粒分子自连产生的。这种方法要求靶 DNA 分子与载体的连接消除其限制性酶切位点。在这个过程中还必须防止内切酶消化连接反应产生的重组子。在连接反应中，单位长度的线性载体分子不断产生（或再生）的净效应将驱使连接反应的平衡态向有利于载体与插入片段连接产生重组子的方向进展。

操作方法所属实验：PCR 产物的平末端克隆

问PCR产物电泳条带

sakeiiii

会不会是模板有问题，RNA跑胶了吗？后面这个应该是二聚体或者非特异性扩增？也可能引物有问题

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问常规pcr产物电泳结果问题

珠海舒桐

试试换新的缓冲液，电压也要稳定的

实验问答1 回答321 围观

PCR产物克隆(10)

PCR克隆主要有TA克隆法, 限制性酶切与连接法，杂交法和近期开发出来的特异性重组法等。但因为TA克隆法操作最简单，快速和高效的原因，成为Taq聚合酶PCR产物的最佳克隆方法。TA克隆法由Invitrogen发明，并拥有全球TA Cloning商标的专利权。TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）利用Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，在每条PCR扩增产物的3`端自动添加一个3`-A突出端。Invitrogen公司TA克隆系统和Topo TA克隆系统都提供一个线性含

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直接从PCR产物回收纯化DNA (Promega 公司试剂盒)

1)直接加90-100μl纯化缓冲液于1.5ml离心管，再加入30～300μl PCR反应物，Vortex混合； 2)加入1ml树脂轻轻Vortex 3次，每次间隔1分钟； 3)将取出拉杆的注射器筒（3ml）装在纯化柱上，加入上述DNA与树脂混合液，然后装上拉杆，慢慢将混合液推进纯化柱内； 4)卸下注射器筒，拔出拉杆，再将注射器筒装上纯化柱，加2ml 80%的Isopropanol（异丙醇）, 然后装上拉杆，慢慢推出液体以清洗柱子； 5)再次卸下注射器筒，将纯化柱装在

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PCR 产物的平末端克隆

靶基因经 PCR 扩增，样品进行必要的纯化回收后，接下来用平末端进行连接克隆也是分子生物学实验中常规采用的技术路线，实验一般利用噬菌体 T4 DNA 聚合酶等补平扩增 DNA 片段的末端（Weiner 1993; Chuang et al. 1995)。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

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冻融法回收 DNA 片段

冻融法回收DNA片段可用于：（1）获取纯化的DNA片段；（2）回收PCR产物。

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制备克隆用PCR产物的纯化

等)，可通过低融点凝胶电泳从电泳胶上回收纯化目的产物。如果盛有 PCR 反应混合液的离心管上覆盖有一层矿物油，用于防止样品在反复热-冷循环中蒸发，收集反应混合液样品时应该先行离心，然后吸取下层水相液体于一个新的离心管内。2. 加 0.2 倍体积的 5X 蛋白酶 K 缓冲液和终浓度至 50 μg/ml 的蛋白酶 K。温育反应混合液在 37℃ 水浴 60 min。3. 用 75℃ 水浴 20 min 加热灭活反应混合液中的蛋白酶 K。4. 反应混合液用酚: 氯仿与氯仿各抽提一次。5. 用乙醇沉淀法回收 DNA

操作方法所属实验：制备克隆用 PCR 产物的纯化

克隆化的PCR产物连入T载体

由 Taq DNA 聚合酶 PCR 扩增产生的带 3' 突出端为 A 碱基的 DNA 片段能高效地克隆至 T 载体上，这种 T 载体有与 A 碱基互补的未配对 3' T 碱基（Holton and Graham 1991; Marchuk et al. 1991)。

操作方法所属实验：克隆化的 PCR 产物连入 T 载体

问PCR产物为什么会拖带？

bamboopiggy

1.可能是你的胶不匀，2.可能是pcr 产物量比较大，3，可能是pcr产物降解。4.pcr特异性差，产生多种产物，有的产物分子量大

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问PCR产物用来跑电泳跑不出条带

我是金博士

要么胶有问题，可以同时做个参照，要么PCR不稳定，也很正常的，P不出来就要重新设计引物了哦

实验问答1 回答1646 围观

直接从PCR产物回收纯化DNA (Promega 公司试剂盒)

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胶回收纯化DNA

1. 琼脂糖电泳，将特异电泳带用刀切下放入到 EP 管中，称琼脂糖带的重量； 2. 按照每100mg加 400μl 的量加入binding buffer，放入到EP管振荡器中， 45℃～55℃温育振荡，直到所有的琼脂糖都溶解（大概要 5 分钟）； 3. 取出纯化柱，将上述溶解液转移至柱中，室温下放置2 分钟，8,000rpm 离心1 分钟，弃 EP 管中的液体，将纯化柱放回 EP 管中； 4. 加 500μl 的 wash buffer至柱中，8,000rpm 离心

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克隆化的 PCR 产物连入 T 载体

由 Taq DNA 聚合酶 PCR 扩增产生的带 3' 突出端为 A 碱基的 DNA 片段能高效地克隆至 T 载体上，这种 T 载体有与 A 碱基互补的未配对 3' T 碱基（Holton and Graham 1991; Marchuk et al. 1991)。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

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制备克隆实验

本实验介绍PCR产物制备克隆的方法。本实验来源于 PCR 实验指南（第二版），作者：种康，瞿礼嘉。

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TA克隆法

rTaq酶0.25 ul。（5）按以下条件进行PCR反应：94℃预变性3 min；然后进行30个循环反应，其温度循环条件为：94℃变性1 min，57℃退火1 min，72 ℃延伸1 min；循环结束后72℃再延伸5 min。（6）取5 ul PCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。方案二：质粒PCR 1. 碱裂解法少量制备质粒DNA （1）用离心管收集4 ml在LB培养基（含Amp）中培养过夜的菌液，14 000 rpm离心30秒，弃尽上清。（2）用250 ul 已加入RNase

操作方法所属实验：PCR 扩增产物的克隆

变性梯度凝胶电泳(DGGE)

1.PCR反应其中，上游引物加40bp [GC] Clamp。2.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认。3.垂直变性梯度凝胶电泳变性梯度递增的方向与电泳方向垂直。所使用的胶为6%聚丙烯酰胺凝胶，变性浓度为0-100%。其中，含7 M尿素和40%去离子甲酰胺的胶为100%变性，不含尿素和去离子甲酰胺的胶为0%变性。垂直变性梯度凝胶电泳主要是检测引物的最适解链条件（即变性浓度）。PCR产物加上样缓冲液后上样，300-400μl/孔，电压150V，温度60℃，时间2-4小时。4.平行变性梯度凝胶电泳变性

操作方法所属实验：变性梯度凝胶电泳