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问
关于
PCR
实验中DNA
聚合酶
的问题？
Dr_劉医生
肯定会抑制扩增呀，酶加多了就会对扩增反应产生抑制作用。
3 回答
840 围观
问
加好的
PCR
预混液（有
聚合酶
，没有探针、引物、模板）可以四度冰箱过夜吗。
迟C迟
可以的，现在商业化的酶还是比较稳定的，我们实验室也常预混放四度，当然长时间保存还是建议-20或者-80℃保存。
3 回答
612 围观
问
pcr
扩增中用到的DNA
聚合酶
有哪几种，怎么选择用哪种？预混的好，还是自配的好
天一湖医者
A.Klenow片段：为DNA
聚合酶
Ⅰ的片段，有
聚合酶
活性和3’~5’外切酶活性（最适37℃）；B.Taq酶：耐热DNA
聚合酶
，可耐受93～95摄氏度（最适74-75℃），是
PCR
普及的关键。它避免了不断补加DNA
聚合酶
的繁琐操作，提高了退火和延伸的温度，减少了非特异性产物和DNA二级结构对
PCR
的干扰，提高了
PCR
的特异性、敏感度和产量。它没有3’~5’外切酶活性，无校对功能，点突变较多。依赖镁离子。C.Stoffel片段：第二代耐热DNA
聚合酶
，去除Taq酶的5’~3’外切酶活性，将97
6 回答
2533 围观
问
如何提高DNA浓度？
土井挞克树
浓度不够的时候可以加引物，或者
聚合酶
链式反应
2 回答
1487 围观
问
PCR
反应条件的三要素
珠海舒桐
PCR
（
聚合酶
链反应）是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。
PCR
反应条件的三要素通常指的是：1. 模板DNA：这是需要被扩增的DNA片段。它可以是基因组DNA、质粒DNA或任何其他形式的DNA。2. 引物（Primers）：这些是短的单链DNA片段，它们与目标DNA序列的两端互补，用于指导DNA
聚合酶
开始合成新的DNA链。3. 热稳定DNA
聚合酶
：最常见的是Taq
聚合酶
，它能够在
PCR
过程中的高温下保持活性。这种酶负责在引物的指导下合成新的DNA链。除了这三要素，
PCR
反应还需要
1 回答
466 围观
问
荧光信号问题
loveliufudan
在核酸检测中，实验组加入了DNA模板，而空白组中只有用水代替模板，因此实验组应该会有更多的靶分子（模板）可供引物探针与之匹配，从而发生
聚合酶
链式反应
(
PCR
)。这会导致实验组反应体系中产生更多的荧光信号，因为
PCR
产物与探针发生结合后荧光染料被激活，发出荧光信号。相比之下，空白组中没有模板的存在，
PCR
反应几乎不会发生，因此会产生很少的荧光信号。此外，空白组中可能会存在背景噪音或杂质信号，但这些信号的强度通常不足以与实验组的荧光信号相比。因此，在流式检测中，实验组的荧光信号应该比空白组的荧
2 回答
168 围观
问
RT-
PCR
的体系的构成？
天一湖医者
PCR
反应体系由寡核苷酸(引物)、4 种dNTP、Taq DNA
聚合酶
、靶序列DNA和
PCR
反应缓冲液体系组成。
5 回答
752 围观
问
高保真酶怎么选择？
大明天桃子
传统的高保真酶例如pyrobest没有什么可说的，保真性一般是普通Taq酶的10倍以内。但传统的高保真酶最大的缺点是扩增能力差，长一点儿的基因很难有效扩增，要摸很多条件，一个字麻烦。最近可以买到的高保真酶选择的机会多一点儿了，有宝生的primer star，还有人提示的Taq plus（这个酶没有详细了解过），上述这两个酶的扩增能力我没有详细了解过，有兴趣的可以去打听一下。最高保真的酶可能要数NEB的phusion了，比普通的taq酶保真性高50倍，扩增能力又超强，1k/15s，扩增长度为10
1 回答
5938 围观
问
p 一段 579bp 的基因，p 了 n 次都没成功是为什么？
benjimmy33108
如果就是第二个碱基一个有多态性，那么一般不会有多大影响的，建议你换一个
聚合酶
试一试，我P过很基因，有些基因就是有一些酶怎么设置都P不出来，结果其他几种可能就能P出来，或者你可以拿最普通的2X预混的先摸一下退货温度之后，看看能否P出来，再进行高保真的
PCR
.
2 回答
2099 围观
问
杆状病毒表达
sswei
PCR
的成功与否与模板、引物、DNA
聚合酶
及其他反应组分、反应条件这四大要素紧密相关。任一个出问题，就不会出现条带。
3 回答
306 围观
问
dUTP与dTTP
Dr_劉医生
用dU不会对dT有影响，在
PCR
产物或引物中用dU代替dT。这种dU化的
PCR
产物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA
聚合酶
的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG对不含dU的模板无任何影响。UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。
2 回答
3605 围观
问
PCR
是在体外提供模板，高温变性，低温退火，室温延伸后才开始进行DNA片段的扩增的嘛
秋秋欣欣
PCR
是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA
聚合酶
最适反应温度（72°C左右），DNA
聚合酶
沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
3 回答
309 围观
问
请问有什么办法可以扩GC含量高的片段吗？
迟C迟
可以购买生物公司专门的
聚合酶
，是专门对高GC含量的, 当扩增具有复杂的二级结构 (GC rich等) 的模板或具有重复序列的模板时,使用GC Buffer进行
PCR
扩增将非常有效。
4 回答
680 围观
问
扩5000多的片段，分两段扩增的，总是有突变怎么办？
loveliufudan
PCR
扩增过程中产生突变可能由多个因素引起，这里有一些可能的解决方案：1.使用高保真
聚合酶
：你已经使用了高保真
聚合酶
，这是非常好的，因为它们比常规的
聚合酶
有更低的突变率。你可以尝试更换不同品牌的高保真酶，看看是否有改善。2.优化扩增条件：过高的扩增温度或过多的扩增循环数可能会导致DNA损伤和突变。你可以尝试优化扩增条件，例如降低扩增循环数，减少模板DNA的量。3.检查模板DNA质量：模板DNA的质量也可能影响
PCR
结果。尽量使用纯净、完整的模板DNA。4.优化连接条件：在二段
PCR
连接过程中
3 回答
2301 围观
问
荧光免疫
PCR
用什么仪器获得不同颜色标记的结果？
苍狼-huahua
现在市场上的
PCR
仪器多种多样，各自采用获取荧光标记结果的方式大不相同。现在潮流方向是用荧光探针(带有标记基因的片段和荧光基团)参与
聚合酶
链反应，当荧光强度达到机器可以判读的阈值，系统的原始扩增曲线就会上扬。
2 回答
1294 围观
问
PCR
扩增不出来，该怎么改进？
高山云初
再纯化或沉淀和洗涤DNA，去除可能会抑制DNA
聚合酶
的残留盐分或离子（如， K+, Na+等）。4)选择具有 高合成能力的DNA
聚合酶
，这类
聚合酶
对土壤、血液和植物组织携带的常见
PCR
抑制剂具有较好的耐受性。3、用量不足建议方法：1)检查 DNA起始量 ，如有需要适当增加起始量。2)选择具有 高灵敏度 的DNA
聚合酶
用于扩增。3)适当增加
PCR
循环数。4、复杂的目的片段（如，高GC含量或含二级结构）建议方法： 1)选择具有 高合成能力的DNA
聚合酶
，这类酶对DNA模板的亲和力较高，更适合扩增困难
5 回答
872 围观
问
质粒电转到毕赤酵母感受态后，涂板，长出菌后，做菌落
pcr
怎么做
loveliufudan
PCR
反应条件：模板：上述提取的上清液引物浓度：0.5 μMTaq
聚合酶
浓度：2.5 U/25 μL反应体系：10× Taq缓冲液、2.5 mM dNTPs、MgCl2、模板、引物和Taq
聚合酶
反应体积：25 μLPCR程序：95℃预变性5分钟，35-40个循环（95℃变性30秒、55℃退火30秒、72℃延伸1-2分钟），72℃最后延伸10分钟。扩增产物可以进行琼脂糖凝胶电泳检测，如果有特异性条带，则可用提取基因的方法纯化扩增产物进行测序。需要注意的是，这种方法提取的DNA纯度和质量可能不如商用试剂
2 回答
386 围观
问
请问
PCR
在组织样中扩增出来条带出现了一千多的，但目的条带在两百左右，而且在细胞样中扩增没有出现一千的条带，可能是什么原因呢？
此用户已注销
PCR
反应扩增产物出现多条带原因：（1）引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。（2）循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。（3）酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。（4）退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的
PCR
扩增。以2度为梯度设计梯度
PCR
反应优化退火温度。（5）样品处理不当。（6）Mg2+浓度偏高，因适当调整Mg2+使用浓度。（7）若为
PCR
试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题
2 回答
484 围观
问
一代测序引物和
PCR
扩增引物的区别？
Eason老歌迷
测序引物分自带引物和通用引物，自带引物为客户自行设计的
PCR
扩增引物或者载体及目的片段上设计的引物进行测序。
PCR
引物又称为寡核苷酸引物，也就是RNA，是由人工合成的，分为两种，引物1和引物2。由于DNA
聚合酶
只能从核苷酸链的5'端到3'端进行复制，也就是只能识别3'的尾端。
3 回答
1135 围观
问
求教，大片段目的基因（6700bp）如何获取？
府宅
可以根据数据库选择表达量高的部位进行模板制备，这样的话，也比较容易扩增出来；可以分成两三段就可以了，选择合适的酶切位点；再次，选择高保真的
聚合酶
，这样扩增出来不容易出现突变，可以适当提高循环数，增大产量，可以设置梯度
PCR
，寻找最优的条件。
3 回答
484 围观
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