小鼠分离肠道隐窝要处理到哪种状态才能算分离完成呀，有图片可以看看吗

要把肠道隐窝完整的暴露出来才算分离完成。

可以通过以下几种方法来判断分离是否完成：

观察肠道隐窝的形态：在分离肠道隐窝的过程中，您可以观察肠道隐窝的形态。当隐窝的形态完整并且没有破损时，可以认为隐窝的分离完成。

观察细胞悬液的浓度：分离完成后，将细胞悬液离心并观察细胞沉淀的量和颜色。如果细胞悬液的浓度较高，且沉淀呈现均匀的白色沉淀，则可以认为隐窝的分离完成。

检测细胞的纯度：为了确保隐窝的分离纯度较高，可以对细胞进行染色并使用显微镜观察。如果细胞中大部分都是肠道隐窝的细胞，则可以认为隐窝的分离完成。

分离小鼠肠道隐窝：

• 在处理肠道的过程中，应先清除肠系膜（连接肠道与腹壁的膜），然后才切割小肠。如果肠系膜未预先去除，在随后的洗涤步骤中肠段则难以沉降。

• 将肠道切割为 2 mm 的小段之后，为确保肠段干净，需要在 PBS 中冲洗 15 至 20 次。如果冲洗次数少于 15 次，则皱襞部分可能会残留一些有毒物质，对类器官的生长产生不利影响。

• 在冲洗过程中需通过重力实现肠段的沉降。若使用离心分离可能会导致其他杂质沉淀，而导致隐窝收获率降低。

将肠道隐窝铺板生成类器官：

• 隐窝经分离后进行铺板时，必须使用预热处理的培养板和水冷的 Matrigel®，这样才可确保隐窝悬浮。如果隐窝接触并粘在孔的表面上，将会出现分化现象。

• 含有肠道隐窝的 Matrigel® 滴液凝固之后，沿孔壁一侧向孔中添加 IntestiCult™ 培养基。如果培养基直接加入到 Matrigel® 的液滴上，液体的作用力会破坏圆顶状的 Matrigel® 液滴。

• IntestiCult™ 培养基应完全覆盖圆顶状的 Matrigel® 液滴。

• 非常重要的是，隐窝应使用三种不同密度进行铺板。培养基和类器官本身均能够产生促使类器官扩增和成活所需的因子。如果隐窝的接种密度过大，则隐窝无法从培养基中吸收充足的营养，实现适当扩增。如果隐窝的接种密度太小，则类器官无法产生充足的因子，从而也会导致无法实现适当扩增。

传代肠道类器官培养物：

• 类器官开始萌芽时，应对类器官进行传代。当细胞死亡时，它们进入管腔，使之变得阴暗。建议在显微镜下观察，确保在类器官培养物管腔变暗之前对其进行传代。

• 在传代过程中，解离类器官有两个要素：在 GCDR 中进行孵育时间以及使用移液管手动搅拌的力度。如果在 GCDR 中对类器官的孵育时间过长或者搅拌过度，则可能会出现过多的单细胞，应避免这种情况