小鼠精原细胞的分离和纯化
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1.小鼠生殖细胞单细胞悬液制备的影响因素
良好单细胞悬液的制备必须首先考虑所用小鼠的日龄。因为随动物日龄的增加，精原细胞开始分化形成各级生殖细胞，其绝对数目及所占生殖细胞的比例都逐渐下降，会给分离纯化增加困难。在成年小鼠的睾丸中，A型精原细胞只占所有精原细胞的1.25%，占未分化精原细胞的10.6%，仅占所有生殖细胞的0.03%［5］ 。因而用来分离精原细胞的动物的日龄应较小为好。一般小鼠选用生后8d的［2］ ，但也有人选用生后10d的；大鼠则选用生后9d的［6］ 。根据我们的前期工作并参考有关报道［2，3］ ，7～8d小鼠的生精上皮内基本只有A型精原细胞和支持细胞，其他各级生精细胞尚未发育形成，理论上可获得最大量的精原细胞。
其次，采用适当的程序及消化方法也是制备良好单细胞悬液的关键环节之一。从小鼠体内取出睾丸之后，我们先用尖镊仔细去除脂肪垫及睾丸白膜，将曲细精管在PBS中吹散，尽量将间质吹打成单细胞及组织碎片。通过静置或低速离心，将其去除，获得较为纯粹的曲细精管段。然后采用两次较短时间的胶原酶消化，将没有消散的睾丸间质消散并释放大部分管周肌样细胞，最大程度地减少了间质组织及管周肌样细胞的污染。最后采用胰蛋白酶、EDTA复合消化液消化，释放支持细胞和精原细胞。实验结果表明，这种程序性的消化过程能有效地分离到较为纯粹的曲细精管段并制备出较高产量和活率的单细胞悬液，同时确保绝大部分间质成分，管周肌样细胞及睾丸外细胞的去除。
2.Percoll不连续密度梯度的分离效果
Percll是一种无毒，惰性，且与生物膜不发生粘附的物质。用它制成的梯度可在室温下放置数星期而梯度的形状不发生丝毫变化。Percoll密度梯度离心已被许多学者用来分离各种动物的精子［7］ ，而用于分离早期生精细胞的报道不多。Bucci等［8］ 用组合酶消化，Percoll等密度梯度离心分离了大鼠的A型精原细胞，所获细胞纯度达到51%。Hofmann等［5］ 用Percoll不连续密度梯度离心，从10d小鼠睾丸分离生殖细胞，结果精原细胞主要分布于密度为1.030的Pecoll梯度中。但文中没有报告所获细胞的纯度。
本实验结果表明，11%～19%Percoll梯度之间主要为死细胞及细胞碎片19%～27%及35%～43%Percoll梯度之间主要是大量支持细胞和少量管周肌样细胞。精原细胞主要分布于27%～35%Percoll梯度间。电镜观察表明，该带中大部分细胞的形态结构特征与相同日龄的小鼠睾丸切片上精原细胞的形态结构一致。该带细胞接种后，根据精原细胞与睾丸体细胞贴壁速度快慢的差异，利用选择性贴壁法，待睾丸体细胞开始贴壁极化而精原细胞仍然悬浮时(体外培养约3～4h)，将其进一步纯化后另行培养；待其贴壁后，依据其形态学特征进行计数，结果精原细胞的纯度平均达到68.76%，高于Bucci等的分离效果。本实验中，支持细胞在3个梯度中都有大量分布，可能与幼年鼠支持细胞非常丰富且其大小很不一致有关。
图版说明
图1 分离细胞的超微结构 ×3 000
图2 分离细胞体外培养3～4h 标尺示50μm
图3 分离细胞体外培养7～8h 标尺示50μm
Explanation of figures
Fig.1 Ultrastructure of separated cells ×3 000
Fig.2 Separated cells after cultured 3-4h Bar=50μm
Fig.3 Separated cells after cultured 7-8h Bar=50μm
【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39770554)
【作者简介】 张学明(1972―)，男，甘肃省高台县人，硕士，助教
通讯作者(To whom correspondence should be addressed)
张学明（解放军军需大学动物科技系组织学胚胎学教研室，长春 130062）
赖良学（解放军军需大学动物科技系组织学胚胎学教研室，长春 130062）
李德雪（解放军军需大学动物科技系组织学胚胎学教研室，长春 130062）
李子义（解放军军需大学动物科技系组织学胚胎学教研室，长春 130062）
文兴豪（解放军军需大学动物科技系组织学胚胎学教研室，长春 130062）
杜惜明（解放军军需大学动物科技系组织学胚胎学教研室，长春 130062）
岳占碰（解放军军需大学动物科技系组织学胚胎学教研室，长春 130062）
王延钊（解放军军需大学动物科技系组织学胚胎学教研室，长春 130062）
参考文献
［1］Meistrich ML, Longtin J, Brock WA, et al. Purification of rat spermatogenic cells and preliminary biochemical analysis of these cells［J］ Biol Reprod,1981,25(3)：1065-1077.
［2］Bellve AR, Cavicchia JC, Millette CF, et al. Spermatogenic cells of the prepuberty mouse［J］. J cell Biol,1977,74(1)：68-85.
［3］张学明，李德雪，李子义，等.小鼠精原干细胞的形态结构特点及其细胞化学和免疫组化特性［J］.中国兽医学报，1999，19(4)：363～367.
［4］Hofmann MC, Narisawa S, Hess RA, et al. Immortalization of germ cells and somatic testicular cells using the SV40 large T antigen［J］. Exper Cell Res,1992,201(2)：417-435.
［5］Tegelenbosch RAJ, De Rooij DG. A quantitative study of spermatogonial multiplication and stem cell renewal in the C3H／101F1 hybrid mouse［J］. Mutation Reserch,1993,290(1)：193-200.
［6］Dym M, Jia MC, Dirami G, et al. Expression of C-kit receptor and its autophosphorylation in immature rat type A spermatogonia［J］. Biol Reprod, 1995,52(1)：8-19.
［7］唐克礼，张李俊，梁全忠等.梯度离心分离家兔精子试验［J］.中国畜牧兽医杂志，1992，28(5)：12～14.
［8］Bucci LR, Rrock WA, Johnson TS, et al. Isolation and biochemical studies of enriched populations of spermatogonia and early primary spermatocytes from rat testes［J］. Biol Reprod,1986,34(1)：195-206.
讨 论
1.小鼠生殖细胞单细胞悬液制备的影响因素
良好单细胞悬液的制备必须首先考虑所用小鼠的日龄。因为随动物日龄的增加，精原细胞开始分化形成各级生殖细胞，其绝对数目及所占生殖细胞的比例都逐渐下降，会给分离纯化增加困难。在成年小鼠的睾丸中，A型精原细胞只占所有精原细胞的1.25%，占未分化精原细胞的10.6%，仅占所有生殖细胞的0.03%［5］ 。因而用来分离精原细胞的动物的日龄应较小为好。一般小鼠选用生后8d的［2］ ，但也有人选用生后10d的；大鼠则选用生后9d的［6］ 。根据我们的前期工作并参考有关报道［2，3］ ，7～8d小鼠的生精上皮内基本只有A型精原细胞和支持细胞，其他各级生精细胞尚未发育形成，理论上可获得最大量的精原细胞。
其次，采用适当的程序及消化方法也是制备良好单细胞悬液的关键环节之一。从小鼠体内取出睾丸之后，我们先用尖镊仔细去除脂肪垫及睾丸白膜，将曲细精管在PBS中吹散，尽量将间质吹打成单细胞及组织碎片。通过静置或低速离心，将其去除，获得较为纯粹的曲细精管段。然后采用两次较短时间的胶原酶消化，将没有消散的睾丸间质消散并释放大部分管周肌样细胞，最大程度地减少了间质组织及管周肌样细胞的污染。最后采用胰蛋白酶、EDTA复合消化液消化，释放支持细胞和精原细胞。实验结果表明，这种程序性的消化过程能有效地分离到较为纯粹的曲细精管段并制备出较高产量和活率的单细胞悬液，同时确保绝大部分间质成分，管周肌样细胞及睾丸外细胞的去除。
2.Percoll不连续密度梯度的分离效果
Percll是一种无毒，惰性，且与生物膜不发生粘附的物质。用它制成的梯度可在室温下放置数星期而梯度的形状不发生丝毫变化。Percoll密度梯度离心已被许多学者用来分离各种动物的精子［7］ ，而用于分离早期生精细胞的报道不多。Bucci等［8］ 用组合酶消化，Percoll等密度梯度离心分离了大鼠的A型精原细胞，所获细胞纯度达到51%。Hofmann等［5］ 用Percoll不连续密度梯度离心，从10d小鼠睾丸分离生殖细胞，结果精原细胞主要分布于密度为1.030的Pecoll梯度中。但文中没有报告所获细胞的纯度。
本实验结果表明，11%～19%Percoll梯度之间主要为死细胞及细胞碎片19%～27%及35%～43%Percoll梯度之间主要是大量支持细胞和少量管周肌样细胞。精原细胞主要分布于27%～35%Percoll梯度间。电镜观察表明，该带中大部分细胞的形态结构特征与相同日龄的小鼠睾丸切片上精原细胞的形态结构一致。该带细胞接种后，根据精原细胞与睾丸体细胞贴壁速度快慢的差异，利用选择性贴壁法，待睾丸体细胞开始贴壁极化而精原细胞仍然悬浮时(体外培养约3～4h)，将其进一步纯化后另行培养；待其贴壁后，依据其形态学特征进行计数，结果精原细胞的纯度平均达到68.76%，高于Bucci等的分离效果。本实验中，支持细胞在3个梯度中都有大量分布，可能与幼年鼠支持细胞非常丰富且其大小很不一致有关。
图版说明
图1 分离细胞的超微结构 ×3 000
图2 分离细胞体外培养3～4h 标尺示50μm
图3 分离细胞体外培养7～8h 标尺示50μm
Explanation of figures
Fig.1 Ultrastructure of separated cells ×3 000
Fig.2 Separated cells after cultured 3-4h Bar=50μm
Fig.3 Separated cells after cultured 7-8h Bar=50μm
【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39770554)
【作者简介】 张学明(1972―)，男，甘肃省高台县人，硕士，助教
通讯作者(To whom correspondence should be addressed)
张学明（解放军军需大学动物科技系组织学胚胎学教研室，长春 130062）
赖良学（解放军军需大学动物科技系组织学胚胎学教研室，长春 130062）
李德雪（解放军军需大学动物科技系组织学胚胎学教研室，长春 130062）
李子义（解放军军需大学动物科技系组织学胚胎学教研室，长春 130062）
文兴豪（解放军军需大学动物科技系组织学胚胎学教研室，长春 130062）
杜惜明（解放军军需大学动物科技系组织学胚胎学教研室，长春 130062）
岳占碰（解放军军需大学动物科技系组织学胚胎学教研室，长春 130062）
王延钊（解放军军需大学动物科技系组织学胚胎学教研室，长春 130062）
参考文献
［1］Meistrich ML, Longtin J, Brock WA, et al. Purification of rat spermatogenic cells and preliminary biochemical analysis of these cells［J］ Biol Reprod,1981,25(3)：1065-1077.
［2］Bellve AR, Cavicchia JC, Millette CF, et al. Spermatogenic cells of the prepuberty mouse［J］. J cell Biol,1977,74(1)：68-85.
［3］张学明，李德雪，李子义，等.小鼠精原干细胞的形态结构特点及其细胞化学和免疫组化特性［J］.中国兽医学报，1999，19(4)：363～367.
［4］Hofmann MC, Narisawa S, Hess RA, et al. Immortalization of germ cells and somatic testicular cells using the SV40 large T antigen［J］. Exper Cell Res,1992,201(2)：417-435.
［5］Tegelenbosch RAJ, De Rooij DG. A quantitative study of spermatogonial multiplication and stem cell renewal in the C3H／101F1 hybrid mouse［J］. Mutation Reserch,1993,290(1)：193-200.
［6］Dym M, Jia MC, Dirami G, et al. Expression of C-kit receptor and its autophosphorylation in immature rat type A spermatogonia［J］. Biol Reprod, 1995,52(1)：8-19.
［7］唐克礼，张李俊，梁全忠等.梯度离心分离家兔精子试验［J］.中国畜牧兽医杂志，1992，28(5)：12～14.
［8］Bucci LR, Rrock WA, Johnson TS, et al. Isolation and biochemical studies of enriched populations of spermatogonia and early primary spermatocytes from rat testes［J］. Biol Reprod,1986,34(1)：195-206.
讨 论
1.小鼠生殖细胞单细胞悬液制备的影响因素
良好单细胞悬液的制备必须首先考虑所用小鼠的日龄。因为随动物日龄的增加，精原细胞开始分化形成各级生殖细胞，其绝对数目及所占生殖细胞的比例都逐渐下降，会给分离纯化增加困难。在成年小鼠的睾丸中，A型精原细胞只占所有精原细胞的1.25%，占未分化精原细胞的10.6%，仅占所有生殖细胞的0.03%［5］ 。因而用来分离精原细胞的动物的日龄应较小为好。一般小鼠选用生后8d的［2］ ，但也有人选用生后10d的；大鼠则选用生后9d的［6］ 。根据我们的前期工作并参考有关报道［2，3］ ，7～8d小鼠的生精上皮内基本只有A型精原细胞和支持细胞，其他各级生精细胞尚未发育形成，理论上可获得最大量的精原细胞。
其次，采用适当的程序及消化方法也是制备良好单细胞悬液的关键环节之一。从小鼠体内取出睾丸之后，我们先用尖镊仔细去除脂肪垫及睾丸白膜，将曲细精管在PBS中吹散，尽量将间质吹打成单细胞及组织碎片。通过静置或低速离心，将其去除，获得较为纯粹的曲细精管段。然后采用两次较短时间的胶原酶消化，将没有消散的睾丸间质消散并释放大部分管周肌样细胞，最大程度地减少了间质组织及管周肌样细胞的污染。最后采用胰蛋白酶、EDTA复合消化液消化，释放支持细胞和精原细胞。实验结果表明，这种程序性的消化过程能有效地分离到较为纯粹的曲细精管段并制备出较高产量和活率的单细胞悬液，同时确保绝大部分间质成分，管周肌样细胞及睾丸外细胞的去除。
2.Percoll不连续密度梯度的分离效果
Percll是一种无毒，惰性，且与生物膜不发生粘附的物质。用它制成的梯度可在室温下放置数星期而梯度的形状不发生丝毫变化。Percoll密度梯度离心已被许多学者用来分离各种动物的精子［7］ ，而用于分离早期生精细胞的报道不多。Bucci等［8］ 用组合酶消化，Percoll等密度梯度离心分离了大鼠的A型精原细胞，所获细胞纯度达到51%。Hofmann等［5］ 用Percoll不连续密度梯度离心，从10d小鼠睾丸分离生殖细胞，结果精原细胞主要分布于密度为1.030的Pecoll梯度中。但文中没有报告所获细胞的纯度。
本实验结果表明，11%～19%Percoll梯度之间主要为死细胞及细胞碎片19%～27%及35%～43%Percoll梯度之间主要是大量支持细胞和少量管周肌样细胞。精原细胞主要分布于27%～35%Percoll梯度间。电镜观察表明，该带中大部分细胞的形态结构特征与相同日龄的小鼠睾丸切片上精原细胞的形态结构一致。该带细胞接种后，根据精原细胞与睾丸体细胞贴壁速度快慢的差异，利用选择性贴壁法，待睾丸体细胞开始贴壁极化而精原细胞仍然悬浮时(体外培养约3～4h)，将其进一步纯化后另行培养；待其贴壁后，依据其形态学特征进行计数，结果精原细胞的纯度平均达到68.76%，高于Bucci等的分离效果。本实验中，支持细胞在3个梯度中都有大量分布，可能与幼年鼠支持细胞非常丰富且其大小很不一致有关。
图版说明
图1 分离细胞的超微结构 ×3 000
图2 分离细胞体外培养3～4h 标尺示50μm
图3 分离细胞体外培养7～8h 标尺示50μm
Explanation of figures
Fig.1 Ultrastructure of separated cells ×3 000
Fig.2 Separated cells after cultured 3-4h Bar=50μm
Fig.3 Separated cells after cultured 7-8h Bar=50μm
【基金项目】国家自然科学基金资助项目(39770554)
【作者简介】 张学明(1972―)，男，甘肃省高台县人，硕士，助教
通讯作者(To whom correspondence should be addressed)
张学明（解放军军需大学动物科技系组织学胚胎学教研室，长春 130062）
赖良学（解放军军需大学动物科技系组织学胚胎学教研室，长春 130062）
李德雪（解放军军需大学动物科技系组织学胚胎学教研室，长春 130062）
李子义（解放军军需大学动物科技系组织学胚胎学教研室，长春 130062）
文兴豪（解放军军需大学动物科技系组织学胚胎学教研室，长春 130062）
杜惜明（解放军军需大学动物科技系组织学胚胎学教研室，长春 130062）
岳占碰（解放军军需大学动物科技系组织学胚胎学教研室，长春 130062）
王延钊（解放军军需大学动物科技系组织学胚胎学教研室，长春 130062）
参考文献
［1］Meistrich ML, Longtin J, Brock WA, et al. Purification of rat spermatogenic cells and preliminary biochemical analysis of these cells［J］ Biol Reprod,1981,25(3)：1065-1077.
［2］Bellve AR, Cavicchia JC, Millette CF, et al. Spermatogenic cells of the prepuberty mouse［J］. J cell Biol,1977,74(1)：68-85.
［3］张学明，李德雪，李子义，等.小鼠精原干细胞的形态结构特点及其细胞化学和免疫组化特性［J］.中国兽医学报，1999，19(4)：363～367.
［4］Hofmann MC, Narisawa S, Hess RA, et al. Immortalization of germ cells and somatic testicular cells using the SV40 large T antigen［J］. Exper Cell Res,1992,201(2)：417-435.
［5］Tegelenbosch RAJ, De Rooij DG. A quantitative study of spermatogonial multiplication and stem cell renewal in the C3H／101F1 hybrid mouse［J］. Mutation Reserch,1993,290(1)：193-200.
［6］Dym M, Jia MC, Dirami G, et al. Expression of C-kit receptor and its autophosphorylation in immature rat type A spermatogonia［J］. Biol Reprod, 1995,52(1)：8-19.
［7］唐克礼，张李俊，梁全忠等.梯度离心分离家兔精子试验［J］.中国畜牧兽医杂志，1992，28(5)：12～14.
［8］Bucci LR, Rrock WA, Johnson TS, et al. Isolation and biochemical studies of enriched populations of spermatogonia and early primary spermatocytes from rat testes［J］. Biol Reprod,1986,34(1)：195-206.
