原理
为了获得某种微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧等条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微生物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微生物无论是数量和种类都是极其多样的，因此，土壤是我们开发利用微生物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株。
材料与仪器
土样
高氏1号琼脂培养基 肉膏蛋白胨琼脂培养基 马丁氏琼脂培养基 酚 链霉素
三角烧瓶 试管 玻璃珠 无菌玻璃涂棒 无菌吸管 接种环
高氏1号琼脂培养基 肉膏蛋白胨琼脂培养基 马丁氏琼脂培养基 酚 链霉素
三角烧瓶 试管 玻璃珠 无菌玻璃涂棒 无菌吸管 接种环
步骤
1. 稀释涂布平板法
（1）倒平板将肉膏蛋白胨培养基、高氏1号琼脂培养基、马丁氏琼脂培养基溶化，待冷至55~60℃时，向高氏1号琼脂培养基中加入10%酚数滴，向马丁氏培养基中加入链霉素溶液，使每毫升培养基中含链霉素30 ug。
然后分别倒平板，每种培养基倒三皿，其方法是右手持盛培养基的试管或三角烧瓶，置火焰旁边，左手拿平皿并松动试管塞或瓶塞，用手掌边缘和小指、无名指夹住拔出，如果试管内或三角烧瓶内的培养基一次可用完，则管塞或瓶塞不必夹在手指中。
试管（瓶）口在火焰上灭菌，然后左手将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15 ml，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布，平置于桌面上，待凝后即成平板。也可将平皿放在火焰附近的桌面上，用左手的食指和中指夹住管塞并打开培养皿，再注入培养基，摇匀后制成平板。最好是将平板放室温2~3天，或37℃培养24小时，检查无菌落及皿盖无冷凝水后再使用。
（2）制备土壤稀释液称取土样10 g，放入盛90 ml 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20分钟，使土样与水充分混合，将菌分散。用一支1 ml 无菌吸管从中吸取1 ml 土壤悬液注入盛有9 ml 无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀。然后再用一支1 ml 无菌吸管从此试管中吸取1 ml 注入另一盛有9 ml 无菌水的试管中，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6各种稀释度的土壤溶液。
（3）涂布将上述每种培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5和10-6三种稀释度，然后用三支1 ml 无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6三管土壤稀释液中各吸取0.2 ml 对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀。
（4）培养将高氏1号培养基平板和马丁氏培养基平板倒置于28℃温室中培养3~5日，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2~3日。
（5）挑菌将培养后长出的单个菌落分别挑取接种到上述三种培养基的斜面上，分别置28℃和37℃温室中培养，待菌苔长出后，检查菌苔是否单纯，也可用显微镜涂片染色检查是否是单一的微生物，若有其他杂菌混杂，就要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。
2. 稀释混合平板法
此法与稀释涂布平板法基本相同，无菌操作也一样，所不同的是先分别吸取0.5 ml 10-4、10-5、10-6稀释度的土壤悬液对号放入平皿，然后再倒入溶化后冷却到45℃左右的培养基，边倒入边摇匀，使样品中的微生物与培养基混合均匀，待冷凝成平板后，分别倒置于28℃和37℃温室中培养后，再挑取单个菌落，直至获得纯培养。
3. 平板划线分离法
（1）按稀释涂布平板法倒平板，并用记号笔标明培养基名称。
（2）划线在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10-1的土壤悬液一环在平板上划线。划线的方法很多，但无论哪种方法划线，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使形成单个菌落。
常用的划线方法有下列二种：
①用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3~4条，再转动培养皿约70度角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同法通过第二次平行划线部分作第三次平行划线和通过第三次平行划线部分作第四次平行划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒置于温室培养。
②将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线。划线完毕后，盖上皿盖，倒置温室培养。
（3）挑菌同稀释涂布平板法，一直到菌分纯为止。
注意事项
1. 在接种时，需要在酒精灯旁操作，以维持一个相对无菌的环境。接种环与试管口不得任意放在桌上或与其他物品相接触。
2. 平板或斜面的划线需要迅速、轻捷，不要划破培养基。
3. 接种完毕后将接种环抽出，灼烧一下管口，塞上硅胶塞，塞硅胶塞时请勿用试管口去迎硅胶塞，以免试管在流动空气中纳入不洁空气。
4. 做平板分区划线分离时，划完一小区，均匀将接种环彻底灼伤灭菌，待冷却后再划下一小区。
5. 所有的培养器皿均需要严格灭菌。
常见问题
1. 菌落是由单个或少数细胞在固体培养基表面或里面生长繁殖所形成的肉眼可见的子细胞群体。菌落形态会因菌种不同或菌种相同但所用的培养基、培养温度、PH值和时间等条件不同而存在不同程度的差异。若所用的培养基、培养温度和时间条件相同，则同一种菌所形成的菌落形态具有相对的稳定性和统一性。
2. 纯培养的确定除了观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能决定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多样性特征鉴定才能确定。
来源：丁香实验
