微生物的分离和纯化

一、目的要求

掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化物的基本操作技术。

二、基本原理

1.从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。本实验采用平板分离法：该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其包括两个方面：

（1）选择适合于待分离微生物的生长条件等要求或者加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物；

（2）微生物在固体培养基生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等计数来完成的。

2.纯培养的确定：

（1）确定其菌落观察特征；

（2）结合显微镜检测个体形态特征的确定。

三、器材

1.菌种：迷曲霉；

2.培养基：高氏Ⅰ号培养基，牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏琼脂培养基，查氏琼脂培养基；

3.溶液或试剂：10%酚 盛9ml无菌水的试管 盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，4%水琼脂；

4.仪器或者其他用具：无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、无菌培养皿、链霉素和土样、显微镜、血细胞计数板等。

四、操作步骤

1. 稀释涂布平板法

（1）倒平板：将肉膏蛋白胨琼脂培养基， 高氏Ⅰ号琼脂培养基；马丁氏琼脂培养基加热溶化，待冷至55-60℃， 高氏Ⅰ号琼脂培养基加入10%酚数滴，马丁氏琼脂培养基加入链霉素溶液。混匀后分别倒平板，每种培养基倒三皿；

（2）制备土壤稀释溶液：称取土样10g，放入盛有90ml无菌水并带入玻璃珠的三角烧瓶，振动约20min，使土样与水分混合，将细胞分散.用一支1ml无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1ml加入另一个盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此推制成10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6不同稀释的土壤溶液；

（3）涂布：将上述每种培养基的三个平板地面分别用记号笔写上10-4，10-5，10-6三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10-4，10-5，10-6三管土壤稀释液中各取0.1ml对号放入已写好室温下静置5-10min，使菌液吸附进培养基；

（4）培养：将高氏Ⅰ号琼脂培养基平板;马丁氏琼脂培养基平板倒置于28℃温室中培养3-5天，肉膏蛋白胨平板倒置于37℃温室中培养2-3天；

（5）挑菌落：将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到上述三种培养基的斜面上，分别置28℃和37℃温室培养，大菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是为单一的微生物。若发现有杂菌，需要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。

2.平板划线分离法

（1）倒平板：按稀释涂布平板倒平板，并用记号标明培养基名称，土样编号和实验日期；

（2）划线：在近火焰处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述的土壤悬液一环在平板上划线.划线的方法很多，但无论采用那种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落；

（3）挑菌落：同稀释涂布平板法，一直到分离的微生物认为纯化为止。