微生物的分离纯化及稀释平板菌落计数

一、自然条件下，微生物常以群落状态存在，这种群落往往是不同种类微生物的混合体。为了研究某种微生物的特性或者要大量培养和使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这种获得纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。

二、稀释平板测数是根据微生物在高度稀释条件下固体培养基上所形成的单个菌落是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，（1）首先将待测样品制成均匀的繁殖稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使其成单个细胞存在，否则一个菌落就不只是代表一个细胞；（2）再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内；（3）经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。此记数方法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。

一、样品稀释液的制备

1. 准确称取待测样品10g，放入装有90mL无菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，用手或置摇床上振荡20min，使微生物细胞分散，静置20～30s，即成10－1稀释液；再用1mL无菌吸管，吸取10－1稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10－2稀释液；再换一支无菌吸管，吸取10－2稀释液1mL，移入装有9mL无菌水的试管中，也吹吸3次，即成10－3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10－4、10－5、10－6、10－7、10－8、10－9等一系列稀释菌液。

2. 用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。样品中所含待测菌的数量多时，稀释度应高，反之则低。通常测定细菌菌剂含菌数时，采用10－7、10－8、10－9稀释度，测定土壤细菌数量时，采用10－4、10－5、10－6稀释度，测定放线菌数量时，采用10－3、10－4、10－5稀释度，测定真菌数量时，采用10－2、10－3、10－4稀释度。   
        

二、平板接种培养

1.混合平板培养法：将无菌平板编上10－7、10－8、10－9号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取1×10－9稀释液各1mL放入编号10－9的3个平板中，同法吸取10－8稀释液各1mL放入编号1×10－8的3个平板中，再吸取1×10－7稀释液各1mL放入编号1×10－7的3个平板中，由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换。然后在9个平板中分别倒入已熔化并冷却至45～50℃的细菌培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷凝后倒置，在30℃下培养。至菌落长出后即可计数。

2. 涂抹平板计数法：涂抹平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.1mL菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上，每个编号设三个重复。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20～30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至菌落长出后即可计数。

三、分离方法

1.混菌法：按“稀释平板测数法”中的“混合平板培养法”进行，使用的稀释度为10－4、10－4、10－6三个，各做3个重复。

2. 涂抹法：按“稀释平板测数法”中的“涂抹平板测数法”进行，使用的稀释度为10－3、10－4、10－5三个，各做3个重复。

3.划线法：用灭菌接种环沾取10-1稀释液1环于已凝固的平板上进行划线（图示）。划线可按以下两种方式进行，一种为交叉划线法，是在平板的一边做第一次“Z”字形划线。转动培养皿70°角，将接种环在火上烧过并冷却后，通过第一次划线部分，做第二次“Z”字形划线。同法进行第三次、第四次划线。另一种为边疆划线法，是从平板边缘的一点开始，连续作紧密的波浪式划线，直至平板中央。转动培养皿180°，再从平板另一边（不烧接种环）同样划线至平板中央。划线法实质上属于一种“由点到线”的稀释法，较适用于含菌比较单一的材料的纯化，对于土壤这类微生物高度混杂的样品则较少使用。

四、培养  

将上述接种过土壤悬液的平板倒置，于28～30℃培养，至长出菌落为止（24～36h）。                           

五、挑菌纯化

在平板上选择分离较好的有代表性的单菌落接种斜面，同时作涂片检查，若发现不纯，应挑取此菌落做进一步划线分离，或制成菌悬液再做稀释分离，直至获得纯培养体。                                                         

六、计数

选取混菌法和涂抹法中每皿菌落数30～300的平板，分别按“稀释平板测数法”中的“混合平板测数法”和“涂抹平板测数法”中的公式计数。这样求得的是每克原始土样中的活菌数，若要折算为每克干土的含菌数，还应将此数值除以干土在土样中所占的质量分数(烘干土的质量/原土样的质量)。

1. 全过程要在无菌条件下进行。

2. 接种环使用前在酒精灯上灼烧至红热。

3. 蘸取少量菌液，先在培养皿上划一条，不要转动接种环。

4. 灭菌后，培养基冷却到 55℃后应及时进行倒平板操作。如果不能及时操作，需要将培 养基放到 55℃左右的电热箱中保温，以防止琼脂凝固。

5. 实验后，所有用过的培养基，培养液等都需要统一进行高压蒸汽灭菌后再丢弃医疗垃圾处，防止造成环境污染。

1. 一般来说以平板上的菌落数介于30-300个的为准，用菌落数乘以稀释度再根据你涂平板的菌液量来计算CFU，如果有两个稀释度的菌落数都是介于30-300之间，则分别计算不同稀释度的菌落数，然后再平均。同一稀释度的三个平板如果菌落数都差不多，则分别计算CFU再平均，如果有一个和其他两个差异很大，则建议取那两个差异不大的平均或者再重复涂平板一次。

2. 如果要计算总菌数，则最好用计数板，一般的血细胞计数板由于太厚，不能用油镜，只能用于酵母菌计数，细菌的话要用细菌计数板。