长白猪精原细胞的分离和纯化

一、材料和方法

1、实验动物

长白种系公猪，2月龄，由北京养猪中心苇沟现代化猪场提供。取活体睾丸，立即放入1640营养液中，待分离细胞。

2、主要试剂及材料

胶原酶（CLS，Sigma），胰蛋白酶（Sigma），脱氧核糖核酸酶（DNase,Promega），牛血清白蛋白（BSA，中国医学科学院天津血液研究所），胎牛血清（FBS，Gibco），RPMI 1640培养基（Gibco，临用前配制，加链霉素及青霉素至终浓度分别为100mg L及80IU ml，调pH至7 3），其他化学试剂均为国产分析纯。800ml容量的细胞沉降池（定做）。

实验用金属及玻璃器皿用前均清洗干净并高压灭菌处理。

3、石蜡切片的制备及染色

新鲜睾丸除去包膜及白膜，切取0 5~1 0cm3左右的小块，立即置入Bouin固定液中，4℃固定24h。按常规步骤制作石蜡切片，HE染色。

4、单细胞悬液的制备

无菌操作置睾丸于PBS溶液中，小心切开包膜，除去脂肪、附睾及白膜，切取1g左右睾丸组织，用弯剪剪成1mm3大小的碎块，移入离心管，加5ml含0.5g L胶原酶的PBS，33℃温育15min，其间不断震摇并用吸管吹吸数次。静置4~5min，待组织和细胞沉降管底后，弃上清。

重复上述步骤1次。加入5ml含0.5g L胰蛋白酶和1.0mg LDNase的PBS，33℃，温育15min，吸管轻轻吹打3min直至滴片镜检时视野中全是散在的单细胞及少量小的细胞团。1000r min离心10min，弃上清，并用PBS清洗两次，细胞沉淀最后重悬在含0. 5%BSA的PBS中，100目筛网过滤，制成单细胞悬液并进行细胞计数。

5、细胞的沉降分离

固定沉降池并保持水平状态，池底下口周围加数十粒硅化玻璃珠。10mlPBS及10ml待分离的单细胞悬液按先后从底部下口载入沉降池。用1640培养液分别配制4%和2%的BSA溶液各250ml，同时分别倒入梯度发生器的两个容器中。

梯度发生器出液口直接用橡胶软管连接于沉降池的底部尖嘴下口。打开活塞，调整流速，使BSA溶液以15ml min的速度从底部进入沉降池。最终沉降池内的液体从上而下形成2%~4%的BSA连续梯度。

整个沉降系统4℃静置3h，以使细胞按不同大小在BSA连续梯度介质中通过自然重力沉降而分层。分层后的细胞溶液从沉降池底部下口用自动收集器收集，控制流速为5ml/min，10ml 管作为1份。1000r min离心10min，沉淀细胞，弃上清。

细胞重悬于0.5ml含0 5%BSA的1640培养液中。将各管细胞分别滴片，HE染色，光学显微镜下检测细胞的形态结构特征及均一程度，以确定细胞的类型及纯度。合并同类细胞，取1滴细胞悬液，加10μl0.4%台盼蓝，计细胞总数及死亡细胞百分比。

最后调整细胞浓度为106个/ml。滴片，染色。显微镜下任选5个视野，计算细胞纯度。

6、细胞的贴壁培养及纯化

经沉降分离的精原细胞中混有少量支持细胞及间质细胞，将此细胞悬液接种到一次性无菌培养瓶中，于37℃、5%CO2及饱和湿度等条件下培养6~8h，支持细胞和间质细胞贴壁而精原细胞尚未贴壁，轻轻摇动培养瓶使精原细胞充分悬浮，吸出培养液，显微镜下再次检测细胞纯度及数量，并计算均值。

二、结果和讨论

1、石蜡切片的观察

在400倍光学显微镜下观察2月龄未成熟公猪的睾丸组织石蜡切片。此时的睾丸组织主要为间质及刚刚发育的曲细精管。间质组织主要由间质细胞组成；曲细精管上皮主要由紧贴基膜的精原细胞以及支持细胞组成，两者均由原始精原细胞分化而来，尚未见初级精母细胞。从切片可见2月龄猪曲细精管尚未发育形成管腔。

2、重力沉降分离后的细胞分类及纯度

未成熟猪睾丸组织的单细胞悬液经BSA连续梯度沉降分离后，根据其形态特征可将收集的细胞合并为4类。第2~15份合并为第Ⅰ类细胞，20~33份合并为第Ⅱ类，38~44份合并为第Ⅲ类，46~50份合并为第Ⅳ类。它们的主要组成、细胞纯度及活细胞比例等详见附表。其中第Ⅱ类为我们所要的精原细胞，纯度达到91%。细胞组成cells纯度（%）purity（%）存活率（%）viability（%）Ⅰ细胞团（cellclumps）-95Ⅱ精原细胞（spermatogonia）9197Ⅲ支持细胞（sertolicells）9597Ⅳ细胞碎片及非细胞结构（cytoplasm）--  本实验中所获得的第Ⅳ类组分属于一种直径只有2~3μm的非细胞结构物质，着色较深，无细胞核及胞质内含物。Bellve等在分离幼年小鼠的生精细胞时也分离到类似结构和特征的物质，并命名为cytoplasm.我们在分离成年小鼠及猪的睾丸生殖细胞时也得到了此类物质，说明它的存在在猪和鼠之间没有动物种属和发育阶段的特异性。其来源、功能及超微结构尚未见报道。3 贴壁培养后的细胞纯度

间质细胞和支持细胞在体外培养时容易贴壁。我们将BSA重力沉降分离后获得的精原细胞（其中少量的杂细胞主要为支持细胞，还有个别间质细胞）接种于培养瓶中，6~8h后，支持细胞和间质细胞贴壁生长而精原细胞仍呈悬浮状态。利用此选择性贴壁法可将精原细胞进一步纯化。收集悬浮精原细胞并经HE染色，在光学显微镜下任选5个视野，细胞纯度分别为93%、94%、96%、93%及95%，平均值为94.2%，高于沉降分离后91%的纯度。

4、光学显微镜下2月龄猪睾丸组织各类细胞的形态学鉴定

显微镜下可见精原细胞呈圆形或卵圆形，直径11~13μm，胞质少，核大，核内常染色质占多数，近核膜处由2~4个核仁。支持细胞外形不规则，胞质多且着色浅，核小，核内染色质少，近核膜处染色质较多，1~2个核仁，培养时先于精原细胞贴壁，贴壁后铺展成梭形或多角形，上述细胞形态特征与2月龄猪睾丸组织石蜡切片的细胞形态完全一致。我们曾采用不同的方法及介质用于幼年猪精原细胞的分离，试图找到一种最佳分离方法。本实验方法的建立，对获得哺乳动物高纯度的生精细胞，进一步深入研究精子发生的分子机制以及分离和培养生精干细胞等方面都有重要的参考价值。