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最重要的是注意污染,肠道本身细菌比较多,必须保持无菌操作,以避免细胞被细菌、真菌等微生物污染。
高山云初
步骤
(1)C57BL/6 小鼠颈椎脱臼处死,喷适量酒精,滴加适量 Buffer 快速分离结肠;
(2)沿肠系膜剪开,DMEM 培养基清洗去除肠腔内容物;
(3)无菌剪刀将结肠组织剪成 1mm3 左右碎片;
(4)10 mL 0.1% 胶原酶 I 和 3% 分散酶 II 消化组织,37℃,摇床消化 25 min;
(5)吹打混匀,100 μm 细胞过滤器过滤,收集上清;
(6)相差消化法、差速贴壁法去除成纤维细胞;
(7)加入 1 mL 培养基重悬细胞,接种于培养瓶完全培养基中,37℃,5% CO2 细胞培养箱中培养;
(8)细胞长至培养瓶 80-90% 后用 5 g/L 的胰酶消化液消化,接种于细胞培养板。
常见问题
1. 实验前所有器械消毒,高压灭菌,液体无菌过滤;
2. 酶消化液现用现配;
3. 实验中注意充分消化以保证检测细胞量足够;
4. 尽可能充分去除成纤维细胞;
5. 用于后续培养需保证全程无菌操作。
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可以借鉴一下下面这个文献参考:
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原代肠道上皮细胞培养的方法文献如图