balalaLy
6孔板或者培养皿的细胞提蛋白,是直接把裂解液加到板里面还是应该先把细胞刮下来收集到ep管中再加裂解液啊?
是TTT
先加裂解液,裂解完以后再刮取细胞到ep管里面,这样更科学
zznh
1.根据实验需要取出需要提取的细胞培养板,置于冰上,用吸引器吸除上清液。PS:所有操作均应在在冰上进行。
2.每孔细胞(六孔板)中加入 1-2ml 4℃预冷的PBS溶液。平放轻轻摇动十秒钟清洗细胞,然后吸除洗液,共清洗洗细胞三次(目的是去除剩余的上清液),最后一次不吸除上清液。
3. 用刮勺将细胞轻轻刮下,接着用移液器将细胞和上清液转移至1.5ml离心管中,置入4度离心机(提前开离心机预冷),离心1.5min,弃去上清液。
4.配置裂解液(所用裂解液为RIPA裂解液,可以使蛋白得到充分释放),每 1ml 裂解液加 10 μl PMSF(100mM),摇匀置于冰上。(PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合)。PS:PMSF属于蛋白酶抑制剂,可以减少蛋白质的讲解,另外的蛋白酶抑制剂还可以用cocktail,NaF,NaN3等,也可以同时加入多种蛋白酶抑制剂。
5.将配置好的裂解液加入第3步获得的细胞沉淀中,一般undefined10^6个细胞加入100ul的裂解液,然后吹打重悬,使细胞充分裂解。
6.用超声仪进一步裂解细胞:将细胞放置于冰上进行超声,一般功率选择为15%左右,裂解时间为1分钟(超声2s,休息4s),当超声一次后,离心管仍比较浑浊,可以间隔几分钟再次超声。
7.超声结束后,将细胞于4度离心机,12000rpm离心 25min。
8.将离心后的上清分装转移至1.5ml 离心管,保存于-80℃备用。
huarenqiang5
建议先把细胞刮下来收集到ep管中再加裂解液。
z流沙z
可以直接加裂解液进去细胞中,裂解的时候刮下来到ep管中
来一起探讨
在提取细胞蛋白前,用pbs将培养基清洗干净,然后可以直接加裂解液在6孔板中,要注意在冰上进行操作
loveliufudan
两种方法都可以用于蛋白提取,但选择哪种方法可以根据您的实验需求和个人偏好来决定。
如果您选择将裂解液直接加到6孔板或培养皿中:
• 确保裂解液能够均匀覆盖到细胞的表面,以确保充分的细胞裂解和蛋白释放。
• 使用足够的裂解液量,以确保液体覆盖整个细胞层。
• 轻轻摇晃6孔板或培养皿,以帮助促进裂解液与细胞的接触和混合。
如果您选择先将细胞刮下来收集到EP管中再加入裂解液:
• 使用细胞刮片或细胞刮剂将细胞从培养皿或6孔板上刮下,尽量收集所有的细胞。
• 将细胞收集到预冷的EP管中。
• 加入足够的裂解液量以覆盖细胞,并确保裂解液与细胞均匀混合。
• 利用离心机离心EP管,以帮助裂解液和细胞的混合。
无论您选择哪种方法,都需要注意以下事项:
• 使用适当的裂解液,可以根据实验需求选择含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液。
• 按照蛋白提取方法的要求和步骤进行,例如冷冻-解冻周期、振荡或离心等步骤。
毛利小五郎的徒弟
把裂解液加到板里效果好一些,细胞裂解不会浪费
sswei
应先用裂解液,裂解时间到后,使用细胞刮刀刮下细胞。
简简单单的8872
直接将裂解液加入到6孔板中提取总蛋白
dxyc42u
我们实验室是刮下来再加裂解液。
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