细胞裂解和提取蛋白等相关问题

DXY网友mao_xianwang问：最近测酶活性，但觉问题一大堆！

1、接种六孔板时如何尽量让细胞接种均匀？

2、给细胞染毒时我听说有两种方案，比如说染三天毒

（1）先接种20%-30%，三天之后收获时刚好长满

（2）一开始就接种70%-80%，然后以3%或者5%血清，这样尽量不让细胞分裂增值，三天之后收获试问，哪个更可行呢？

3、提总蛋白时有人先把细胞吹下来然后裂解，有人直接把裂解液加进板子，哪个更好些？可否提供两种方案的具体步骤？

4、裂解后一定会出现粘稠物质吗？

DXY网友SmallDonkey回复：

1、首先接种量要一致，然后加到板子中后用十字交叉法晃动平板摇匀，再生长12-24 h，让都长到89-90%左右，一般问题不大

2、这个不懂，但是个人认为如果确定不了，可先做次预实验比较一下，当然可能病毒不那么方便，看情况吧

3、各有利弊：消化下来再裂解，有可能有酶的污染，使蛋白不稳定，但是可以将蛋白浓度弄得比较大；直接加进板子里裂解不会有外源污染，但是蛋白浓度会比较固定，如果目的蛋白量很低就不适合了。至于具体步骤，要根据楼主所用的试剂不同不太一样，最好使用公司试剂盒，根据说明书来（省心。。。不过费钱。。。）

4、是指基因组吗？有许多方法可以去除的，比如加入DNase或者超声等等

DXY网友xulees问：请问楼上什么叫做十字交叉法呢？如果要摇匀，接种后我把培养板放到摇床去摇可以吗？

还有试剂盒，战友你用过吗？它们叫什么名字？目的都是什么？

DXY网友SmallDonkey回复：十字交叉就是将板子贴着桌子，先前后晃再左右，以十字的形式晃动，将细胞晃匀，防止成簇。摇床力量太大了，容易染菌，不推荐。试剂盒我用过RIPA裂解液，那个公司的忘了，主要是裂解液，自己再加点PMSF就行了

DXY网友capricornkey回复：十字交叉，就是6孔板贴着桌面，前后左右晃晃，目的是使细胞分布均匀，摇床没必要，细胞要贴壁生长，一直晃怎么行；我们用的盒子是Pierce的，提蛋白测浓度的，具体货号忘记了，网上搜下应该很好找，目的嘛，当然是提取细胞总蛋白测浓度了；我们都是直接把裂解液加到板子里，避免先用胰酶消化引入蛋白酶，使蛋白降解。

楼主提问：多谢各位！受益颇多！还有一问：裂解液似乎有很多配制方案，就提取总蛋白来讲会有不同效果吗？

DXY网友capricornkey回复：RIPA裂解缓冲液常用配方：（Tris-HCl， 50 mmol/Lol/L， pH 7.5；NaCl， 150 mmol/Lol/L；NP-40， 1%；脱氧胆酸钠， 0.5%；SDS， 0.1%；EDTA， 1 mmol/Lol/L；PMSF， 1 mmol/Lol/L；Leupeptin， 2 μg/ml）

只使用过这一种裂解液，效果不错，其他没使过，不好说效果有没不同，感觉成分应该差不多，可能就差在用的是不同的蛋白酶抑制剂吧。