细胞裂解和提取蛋白等相关问题

DXY网友mao_xianwang问：最近测酶活性，但觉问题一大堆！

1、接种六孔板时如何尽量让细胞接种均匀？

2、给细胞染毒时我听说有两种方案，比如说染三天毒

（1）先接种20%-30%，三天之后收获时刚好长满

（2）一开始就接种70%-80%，然后以3%或者5%血清，这样尽量不让细胞分裂增值，三天之后收获试问，哪个更可行呢？

3、提总蛋白时有人先把细胞吹下来然后裂解，有人直接把裂解液加进板子，哪个更好些？可否提供两种方案的具体步骤？

4、裂解后一定会出现粘稠物质吗？

DXY网友SmallDonkey回复：

1、首先接种量要一致，然后加到板子中后用十字交叉法晃动平板摇匀，再生长12-24 h，让都长到89-90%左右，一般问题不大

2、这个不懂，但是个人认为如果确定不了，可先做次预实验比较一下，当然可能病毒不那么方便，看情况吧

3、各有利弊：消化下来再裂解，有可能有酶的污染，使蛋白不稳定，但是可以将蛋白浓度弄得比较大；直接加进板子里裂解不会有外源污染，但是蛋白浓度会比较固定，如果目的蛋白量很低就不适合了。至于具体步骤，要根据楼主所用的试剂不同不太一样，最好使用公司试剂盒，根据说明书来（省心。。。不过费钱。。。）

4、是指基因组吗？有许多方法可以去除的，比如加入DNase或者超声等等

DXY网友xulees问：请问楼上什么叫做十字交叉法呢？如果要摇匀，接种后我把培养板放到摇床去摇可以吗？

还有试剂盒，战友你用过吗？它们叫什么名字？目的都是什么？

DXY网友SmallDonkey回复：十字交叉就是将板子贴着桌子，先前后晃再左右，以十字的形式晃动，将细胞晃匀，防止成簇。摇床力量太大了，容易染菌，不推荐。试剂盒我用过RIPA裂解液，那个公司的忘了，主要是裂解液，自己再加点PMSF就行了

DXY网友capricornkey回复：十字交叉，就是6孔板贴着桌面，前后左右晃晃，目的是使细胞分布均匀，摇床没必要，细胞要贴壁生长，一直晃怎么行；我们用的盒子是Pierce的，提蛋白测浓度的，具体货号忘记了，网上搜下应该很好找，目的嘛，当然是提取细胞总蛋白测浓度了；我们都是直接把裂解液加到板子里，避免先用胰酶消化引入蛋白酶，使蛋白降解。

楼主提问：多谢各位！受益颇多！还有一问：裂解液似乎有很多配制方案，就提取总蛋白来讲会有不同效果吗？

DXY网友capricornkey回复：RIPA裂解缓冲液常用配方：（Tris-HCl， 50 mmol/Lol/L， pH 7.5；NaCl， 150 mmol/Lol/L；NP-40， 1%；脱氧胆酸钠， 0.5%；SDS， 0.1%；EDTA， 1 mmol/Lol/L；PMSF， 1 mmol/Lol/L；Leupeptin， 2 μg/ml）

只使用过这一种裂解液，效果不错，其他没使过，不好说效果有没不同，感觉成分应该差不多，可能就差在用的是不同的蛋白酶抑制剂吧。

DXY网友lonelymusic回复：

1、接种六孔板时如何尽量让细胞接种均匀？

可以试试先在离心管里配好需要的细胞浓度，再加到孔里，这样稍微晃一晃就行了，但切记不可旋转，但其实如果十字法用的多了，也很方便，用摇床的方法实在让人那个汗！

3、提总蛋白时有人先把细胞吹下来然后裂解，有人直接把裂解液加进板子，哪个更好些？可否提供两种方案的具体步骤？

我用的是三去污裂解液，今天细看后才发现跟RIPA配方差不多。。。

三去污裂解液：

Tris-Cl（pH=8.0） 50 mmol/L

NaCl 150 mmol/L

NaN3 0.02%

SDS 0.1%

NP-40 1%

脱氧胆酸钠0.5%

EDTA 1 mmol/L

具体方法：将35 mmol/L培养皿贴壁超过90%以上，状态良好的细胞置于冰上，弃去细胞培养基，用冰预冷的PBS洗两次，将残留的PBS尽量吸干，再加入30-40 μl三去污细胞裂解液（含1 mmol/L PMSF），冰上放置30 min，用枪头将细胞刮下，收集到1.5mlEP管中，4度最高转速离心25 min，收集上清，存放于-30度。

关于加不加蛋白酶抑制剂的问题，我觉得跟你研究的蛋白是否容易降解有关。

其实裂解液里已有不少抑制蛋白酶活性物质存在。

象我正在研究的蛋白，并不需要加PMSF或什么蛋白酶抑制剂cocktail，也能顺利的完成实验。

4、裂解后一定会出现粘稠物质吗？

我的细胞每次都会，通常会以最大转速度离心20-25 min，取上清保存起来。不过要看你收集什么蛋白了，离心后的上清是细胞浆蛋白，细胞膜蛋白都沉淀下来，所以如果是研究细胞膜蛋白就不用离心了。

还有如果你的蛋白容易降解的话，也不能离心太久。

DXY网友ahan回复：回答楼主的第2个问题，个人建议考虑三个因素：细胞的特性（原代抑或是细胞株）、受试物的毒理特性及检测方法的灵敏性：如果是细胞株建议用第一个方法，细胞毒性试验常用的就是第一种方法，原代的推荐第二个方法；就受试物毒性而言如果作用于分离增值期当然考虑第一种方法，反之选二；检测方法的检测性越宽，方法选择的余地越大！当然，最佳方案可能是正交设计后进行预实验选择！

DXY网友ianm回复：回答楼主的第4个问题，裂解后大多会出现。可以用细注射器反复抽吸即可。这样不需要超声设备，也不需要加入DNase了。

DXY网友elnino0622回复：我以前是这样接种的：先混匀，用枪一滴一滴的给每孔加上，没吸一次都吹匀，滴满孔的表面，大概2ml，之后静止2min显微镜下看是否均匀。如均匀，每孔都这样滴加；如不匀，则再滴加细胞悬液，静止再观察。接毒就是等细胞长到80%左右，pbs洗一次，无血清接种，比例是1：100。一段时间后去病毒，正常培养。

DXY网友kaijiewu回复：学习到很多东西，补充一点点：

1、我觉得6孔板提蛋白加裂解液的多少没有定数，大概30-50 μl就可以，具体还要结合自己养的细胞特性，每个细胞体积的大小会影响所加的量，如果细胞本身体积大，那可能细胞数不多，可以少加一点，30 μl，反之50 μl。假如做Western blot，加30 μl足以，况且浓度大了可以用undefinedbuffer稀释后上样，而提得太稀要浓缩则麻烦一些！

2、楼上讨论的6孔板种板的技术我深表同意，因为我就在种板这块浪费了很多时间，SmallDonkey斑竹的十字交叉法很有效，尤其是对100 mm，对小皿可能效果差些，尤其要注意避免旋转混匀，这是新手的一个误区，我就吃过很多次亏！

3、像6孔板这种小孔板种板的关键就是不让细胞扎堆，因为种板后再混匀的效果相对差些，所以种板时的技术就很关键。个人体会就是一定不要忘记每种一孔都要充分吹匀，千万不能小看细胞的沉降速度！

4、还有一个很容易被人忽略的细节就是板子的质量，我就曾在这块摸索了半天，种了近七八块板子才发现是板子的牌子换了，所以无论自己怎么注意都会出现细胞扎堆现象！我推荐用Costar的进口板子，用过一些质量确实可以，只要注意上面这些，细胞肯定不会扎堆。