从标记的细胞或者细胞裂解物中提取ATP

1.从标记细胞提取ATP

1)  备下列材料：

本实验用到的所有溶液必须用Mlli - Q纯化的水或它的等价物配制。

冰冷的4%高氣酺（v/v)

三-n-辛胺

1,1,2-三氮三m乙烷

32p标记的细胞

带螺帽的聚丙烯离心管

测量范围PH4~8的PH试纸

小心：高氣酸■ 三-n -辛胺； U  1，2-三氯三氟乙烧；放射性物质（见附录5)2) 从标记细胞中吸出培养基，用PBS清洗两次。彻底吸去清洗液，将细胞放入冰盒。

迅速加入〇.5ml冰冷的4%高氯酸，轻轻混匀以裂解细胞，冰浴5分钟s将细胞到入酸液，定量转移至一个带螺帽的离心管。于4尤全速离心5 分钟以沉淀细胞碎片。3) 将上清转移至新的离心管，放入冰浴。按 1.2比1的比例新鲜配制三- n -辛胺与1,】，2_三氯三氟乙烷的混合物，混匀。加0.6ml混合物到高氯酸样品，盖紧螺帽，用旋涡混合器振荡1分钟以上。

此时一定要充分混匀，以确保完全中和。

4 ) 完全混匀后，室温离心5分钟Q

离心后溶液明显地分成三层。底y是过届:的二-n -辛咹/I, I，2--:氣二氟乙烷，屮M是高氯酸辛胺（这 -层通常呈黄色），1：层水相是己中和的样品。

5) 吸出上层到新离心管，用PH试纸测pH值。pH值应是PH6~73如果样品f_H值低于6,则重复用-:-n-卡胺/I，丨，2 三氣三婕乙烷处理；这种情况很少见。

此时样品句以进行分析了   管用什么方法，都要有已知A1P浓度的标准样品与测试样品平行用二- ? -辛胺< 24J ■   /U〖，2_—氣三M己坑提取。

2.从细胞裂解物中提取ATP

从细胞裂解物中提取ATP，按上述方法做以下修改即可。

1) 准备下列材料：

标记的细胞裂解物

冰冷的8%高氯酸（v/v)

-辛胺

1，1，2_三氯三氟乙烷

带密封盖子的5-ml聚丙烯离心管

2) 在一个5-ml聚丙烯离心管里，往裂解物中加等量的冰冷的8%高氯酸，放于冰上。

彻底混匀，冰浴5分钟D于4^：离心5分钟或者直至蛋白质完仝沉淀。将 h清吸出到一个新离心管，按上述基本方法屮和53)  蛋白质沉淀后的样品中加1.2倍体积三-re-辛胺/I,2_三氯三氟乙烷，用旋涡混合器充分振荡。然后完全按上述基本方法继续实验。