材料与仪器
步骤
1)准备下列材料：
Whatman Partisphere SAX高效液相层析柱和保护柱线性梯度洗脱液设定在254nm的紫外线监测仪
装配好的0.2;mi Whatman滤膜和滤器
0.2^?过滤的Milli-Q水
0.2/im S@_0,:5m〇l/LNH4H2ro4 (pH4.2).H3P〇4
分步收集器 ^
Whatman 〇.2;<an低残留量注射滤器
■ 242 .
待分析的样品
液闪计数器
2) lml/min的速度用水平衡SAX柱30分钟。
3) 空白梯度洗脱液过柱；即不加样品只用梯度洗脱液流过层析柱。
表28.1给出一个典型的简单梯度。如果用的是5ml加样歼，开始5分钟的空卩1梯度洗脱就可以淸除加样环里的内容物，使之流入层析往。样品的离子强度必须小于2〇〇nn?i/L，无机磷酸才能结合到杜子^ 在文践中，5ml的加样环就很好用，只需在加样前用水柯0.5ml样品稀鞾10倍「4) 在SAX层析柱上洗脱核苷酸标准混合物n —种很好用的核苷酸混合物是：AMP、ADP、ATP、GMP、GDP、GTP，浓 度 都 是 用 10M1的量就能产生很容易被紫外线监测仪在254nm处检测到的洗脱峰。
表28.1离效液相层柘分离核苷醺的梯度轮廓和核苷酸大致滞留时间时 间 大致滞留时间(分钟）(分钟） 哜B AMP/CMP ADP/GDP ATP/CIP0 05 0
70 60 30/35 40/52 75/85
ti5 60
90 100
120 100
125 0
B: Umol/LNH^POit 缓 冲 液 （pH3.8)】S析柱：WhatmanPartkphereSAX，25cmx4.6mm，同丨:；：核廿酸的滞留时间只是个大概的值，因为不㈣的商效液相层析系统产生的梯度释放有轻微的差别，不同的卨效液相层析杆.的分电效果也不一样。
5) —旦标准核苷酸的洗脱有了稳定的结果，就可以开始分析样品。注入4?6个已知浓度的ATP样品，绘制标准曲线，让待测样品落在曲线中央附近。在实践中，这可以根据胞内ATP浓度-般是lfimd/L估算出来，这样从初始细胞体积就吋以粗略地估算出细胞裂解物中ATP的浓度。
6) 待测样品注入SAX层析柱，进行层析，用接在紫外线监测仪后面的分步收集器收集ATP洗脱峰。
Whatman Partisphere SAX高效液相层析柱和保护柱线性梯度洗脱液设定在254nm的紫外线监测仪
装配好的0.2;mi Whatman滤膜和滤器
0.2^?过滤的Milli-Q水
0.2/im S@_0,:5m〇l/LNH4H2ro4 (pH4.2).H3P〇4
分步收集器 ^
Whatman 〇.2;<an低残留量注射滤器
■ 242 .
待分析的样品
液闪计数器
2) lml/min的速度用水平衡SAX柱30分钟。
3) 空白梯度洗脱液过柱；即不加样品只用梯度洗脱液流过层析柱。
表28.1给出一个典型的简单梯度。如果用的是5ml加样歼，开始5分钟的空卩1梯度洗脱就可以淸除加样环里的内容物，使之流入层析往。样品的离子强度必须小于2〇〇nn?i/L，无机磷酸才能结合到杜子^ 在文践中，5ml的加样环就很好用，只需在加样前用水柯0.5ml样品稀鞾10倍「4) 在SAX层析柱上洗脱核苷酸标准混合物n —种很好用的核苷酸混合物是：AMP、ADP、ATP、GMP、GDP、GTP，浓 度 都 是 用 10M1的量就能产生很容易被紫外线监测仪在254nm处检测到的洗脱峰。
表28.1离效液相层柘分离核苷醺的梯度轮廓和核苷酸大致滞留时间时 间 大致滞留时间(分钟）(分钟） 哜B AMP/CMP ADP/GDP ATP/CIP0 05 0
70 60 30/35 40/52 75/85
ti5 60
90 100
120 100
125 0
B: Umol/LNH^POit 缓 冲 液 （pH3.8)】S析柱：WhatmanPartkphereSAX，25cmx4.6mm，同丨:；：核廿酸的滞留时间只是个大概的值，因为不㈣的商效液相层析系统产生的梯度释放有轻微的差别，不同的卨效液相层析杆.的分电效果也不一样。
5) —旦标准核苷酸的洗脱有了稳定的结果，就可以开始分析样品。注入4?6个已知浓度的ATP样品，绘制标准曲线，让待测样品落在曲线中央附近。在实践中，这可以根据胞内ATP浓度-般是lfimd/L估算出来，这样从初始细胞体积就吋以粗略地估算出细胞裂解物中ATP的浓度。
6) 待测样品注入SAX层析柱，进行层析，用接在紫外线监测仪后面的分步收集器收集ATP洗脱峰。
来源：丁香实验
