用高效液相层析定量测定ATP

1)准备下列材料：

Whatman Partisphere SAX高效液相层析柱和保护柱线性梯度洗脱液设定在254nm的紫外线监测仪

装配好的0.2;mi Whatman滤膜和滤器

0.2^?过滤的Milli-Q水

0.2/im S@_0,:5m〇l/LNH4H2ro4 (pH4.2).H3P〇4

分步收集器     ^

Whatman 〇.2;<an低残留量注射滤器

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待分析的样品

液闪计数器

2)   lml/min的速度用水平衡SAX柱30分钟。

3)  空白梯度洗脱液过柱；即不加样品只用梯度洗脱液流过层析柱。

表28.1给出一个典型的简单梯度。如果用的是5ml加样歼，开始5分钟的空卩1梯度洗脱就可以淸除加样环里的内容物，使之流入层析往。样品的离子强度必须小于2〇〇nn?i/L，无机磷酸才能结合到杜子^  在文践中，5ml的加样环就很好用，只需在加样前用水柯0.5ml样品稀鞾10倍「4) 在SAX层析柱上洗脱核苷酸标准混合物n —种很好用的核苷酸混合物是：AMP、ADP、ATP、GMP、GDP、GTP，浓  度  都  是  用  10M1的量就能产生很容易被紫外线监测仪在254nm处检测到的洗脱峰。

表28.1离效液相层柘分离核苷醺的梯度轮廓和核苷酸大致滞留时间时 间    大致滞留时间(分钟）(分钟）    哜B    AMP/CMP    ADP/GDP    ATP/CIP0    05    0

70    60    30/35    40/52    75/85

ti5    60

90    100

120    100

125    0

B:  Umol/LNH^POit 缓 冲 液 （pH3.8)】S析柱：WhatmanPartkphereSAX，25cmx4.6mm，同丨:；：核廿酸的滞留时间只是个大概的值，因为不㈣的商效液相层析系统产生的梯度释放有轻微的差别，不同的卨效液相层析杆.的分电效果也不一样。

5) —旦标准核苷酸的洗脱有了稳定的结果，就可以开始分析样品。注入4?6个已知浓度的ATP样品，绘制标准曲线，让待测样品落在曲线中央附近。在实践中，这可以根据胞内ATP浓度-般是lfimd/L估算出来，这样从初始细胞体积就吋以粗略地估算出细胞裂解物中ATP的浓度。

6)  待测样品注入SAX层析柱，进行层析，用接在紫外线监测仪后面的分步收集器收集ATP洗脱峰。