材料与仪器
步骤
准备下列材料：
含有未知浓度mp] ATP的细胞裂解物样品
10mg/ml激酶底物肽渐夜（Calbiochem)
0.5mraol/L cAMP 溶液 I、Calbiochem)
cA-PrK (Calbiochem)
cA-PrK分析缓冲液
lmol/L DTT储存液（^ 2〇尤保存）
0.5mol/LMg〇2
75mmol/L 正磷酸
Whatman P81确酸纤维素滤纸
丙酮
循环水浴
旋涡混合器
小心：强酸和强喊；IHT; MgCl2;丙酮（见附录5)
这_.使用的方法学在下-竹奋更详细的:叙述。CA-PrK分析的细f 4 分析缓冲液和底物的制备/K这里也会讲到2) 将一系列要进行试验的离心管贴上标签。将Wlmt_ P81滤纸切成1英寸的方块,与离心管对应地做上标记（PS1方块的制备见第29节)。
3) 将离心管放在冰上，加入下列成分
25^1含 [32P] ATP的裂解液
5fil l〇x分析缓冲液
l(il 0.5mmol/L cAMP
5W 10mg/ml激酶底物肽
1/zl lmol/L D1T
l^tl 0,5ni〇l/L MgCl2
2^1水
4) 所有离心管都加好以后，盖上盖子，冰浴。
5) 每30秒加入1(^1 cA-PrK溶液，放入301水浴开始反应。
按这样的时间安排进行实验可以经验件地确定合适的反映时间r 60、120, 180弓200分钟都要试一K,选定的时间应_321~8gt~J掺入激醻底物肽的平台期之后。
6) 从每管吸出3〇4到对应的P8]滤纸块表面D立即将滤纸放入含75mmoI/L正磷酸的烧杯。所有反应都如此处理过以后，冲洗P81滤纸5分钟。将磷酸溶液倒入装t 32P的废液的容器。再往烧杯中加入正磷酸，搅拌5分钟。如此冲洗P81滤纸5次。7) 往烧杯中加入丙酮，再冲洗5分钟u 倒掉肉酮，让四1滤纸在室温自然晾干：8) 将每一块P81滤纸放入20ml的液闪计数管，用液闪计数器测定放射性。
含有未知浓度mp] ATP的细胞裂解物样品
10mg/ml激酶底物肽渐夜（Calbiochem)
0.5mraol/L cAMP 溶液 I、Calbiochem)
cA-PrK (Calbiochem)
cA-PrK分析缓冲液
lmol/L DTT储存液（^ 2〇尤保存）
0.5mol/LMg〇2
75mmol/L 正磷酸
Whatman P81确酸纤维素滤纸
丙酮
循环水浴
旋涡混合器
小心：强酸和强喊；IHT; MgCl2;丙酮（见附录5)
这_.使用的方法学在下-竹奋更详细的:叙述。CA-PrK分析的细f 4 分析缓冲液和底物的制备/K这里也会讲到2) 将一系列要进行试验的离心管贴上标签。将Wlmt_ P81滤纸切成1英寸的方块,与离心管对应地做上标记（PS1方块的制备见第29节)。
3) 将离心管放在冰上，加入下列成分
25^1含 [32P] ATP的裂解液
5fil l〇x分析缓冲液
l(il 0.5mmol/L cAMP
5W 10mg/ml激酶底物肽
1/zl lmol/L D1T
l^tl 0,5ni〇l/L MgCl2
2^1水
4) 所有离心管都加好以后，盖上盖子，冰浴。
5) 每30秒加入1(^1 cA-PrK溶液，放入301水浴开始反应。
按这样的时间安排进行实验可以经验件地确定合适的反映时间r 60、120, 180弓200分钟都要试一K,选定的时间应_321~8gt~J掺入激醻底物肽的平台期之后。
6) 从每管吸出3〇4到对应的P8]滤纸块表面D立即将滤纸放入含75mmoI/L正磷酸的烧杯。所有反应都如此处理过以后，冲洗P81滤纸5分钟。将磷酸溶液倒入装t 32P的废液的容器。再往烧杯中加入正磷酸，搅拌5分钟。如此冲洗P81滤纸5次。7) 往烧杯中加入丙酮，再冲洗5分钟u 倒掉肉酮，让四1滤纸在室温自然晾干：8) 将每一块P81滤纸放入20ml的液闪计数管，用液闪计数器测定放射性。
来源：丁香实验
