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核苷和核苷酸的标记〔γ-32P〕-ATP标记

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核苷和核苷酸的标记〔γ-32 P〕-ATP标记
 
     基因工程已广泛应用于医学诊断、重组新的分子、物种和品系。32 P-核苷酸类在基因工程研究中不可缺少的核素标记的化合物。制备这类标记化合物的方法有化学合成法、化学酶促合成法和酶促合成法等。其中常用酶促合成法最常用,其优点是需要设备少,操作简便,时间短,易防护,标记物的放射性比活度高,能够满足基因工程中进行DNA标记及分子杂交等工作要求。
 
【基本原理】
    在酶促反应中,甘油酸-3-磷酸激酶在Mg2+ 存在下,利用ATP首先将甘油酸-3-磷酸磷酸化,形成甘油酸-1,3二磷酸和ADP,然后在甘油醛-3-磷酸脱氢酶催化下,以还原型辅酶I为递氢体,使甘油酸-1,3二磷酸还原并且解磷酸化,形成甘油醛-3-磷酸和无机磷,加入放射性32 P,进一步与ADP结合形成γ-32 P-ADP。
 
【试剂及材料】
(1)H3 32 PO4 溶液:用1mol/L NaOH将pH调至7.0,备用;
(2)反应液:在10ml0.05mol/L,pH8.0 Tris-HC缓冲液中,含6mmol/LMgCl2 ,2mmol/L L-半胱氨酸,0.33mmol/L Na2 SO4 ,0.33mmol/L 5’-ATP-Na,0.1mmol/L辅酶I和0.33mmol/L甘油醛-3-磷酸钠盐(将甘油醛-3-磷酸钡盐用HCl少许溶解后与Na2 SO4 溶液混合,离心取上清液)。
(3)甘油酸-3-磷酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(需预处理去除保存液中的硫酸胺:将200ml甘油酸-3-磷酸激酶和60ml甘油醛-3-磷酸脱氢酶,置于含2mmol/L 谷胱甘肽和 0.1mmol/L辅酶I 的0.01mol/L,pH8.0 Tris-HC缓冲液中,透析过夜,更换透析液3次)
 
【操作方法】
(1)在反应管中加入适量反应液、酶液和H3 32 PO4 溶液(370MBq),总体积约2ml,混匀后,置37℃温育30min;
(2)将反应液过DEAE-Sephadex A-25柱(DEAE-Sephadex A-25为阴离子交换柱分离纯化产品,〔γ-32 P〕-ATP的回收率可达90%,洗脱液较温和,pH适中,对产品无损伤)。柱先用0.15mol/L NH4 HCO3 淋洗,然后用0.5mol/L NH4 HCO3 淋洗脱,流速1ml/min,分瓶收集洗脱液7-8m1,每瓶1ml;
(3)在洗脱液中,加入一定量的三乙胺和95%乙醇溶液,真空低温冷冻干燥,后,再加入95%乙醇两次,将NH4 HCO3 去除;
(4)取少量乙醇水溶液溶解,用活度计上测定比活度;
(5)再用乙醇水溶液溶解成37MBq/ml,分装冷冻保存。
 
【质量鉴定】
  与上述Ch-T方法相同。
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