核苷和核苷酸的标记〔γ-32P〕-ATP标记

互联网2010-12-02

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核苷和核苷酸的标记〔γ-³² P〕-ATP标记

基因工程已广泛应用于医学诊断、重组新的分子、物种和品系。³² P-核苷酸类在基因工程研究中不可缺少的核素标记的化合物。制备这类标记化合物的方法有化学合成法、化学酶促合成法和酶促合成法等。其中常用酶促合成法最常用，其优点是需要设备少，操作简便，时间短，易防护，标记物的放射性比活度高，能够满足基因工程中进行DNA标记及分子杂交等工作要求。

【基本原理】

在酶促反应中，甘油酸-3-磷酸激酶在Mg²⁺ 存在下，利用ATP首先将甘油酸-3-磷酸磷酸化，形成甘油酸-1，3二磷酸和ADP，然后在甘油醛-3-磷酸脱氢酶催化下，以还原型辅酶I为递氢体，使甘油酸-1，3二磷酸还原并且解磷酸化，形成甘油醛-3-磷酸和无机磷，加入放射性³² P，进一步与ADP结合形成γ-³² P-ADP。

【试剂及材料】

（1）H₃ ³² PO₄ 溶液：用1mol/L NaOH将pH调至7.0，备用；

（2）反应液：在10ml0.05mol/L，pH8.0 Tris-HC缓冲液中，含6mmol/LMgCl₂ ，2mmol/L L-半胱氨酸，0.33mmol/L Na₂ SO₄ ，0.33mmol/L 5’-ATP-Na，0.1mmol/L辅酶I和0.33mmol/L甘油醛-3-磷酸钠盐（将甘油醛-3-磷酸钡盐用HCl少许溶解后与Na₂ SO₄ 溶液混合，离心取上清液）。

（3）甘油酸-3-磷酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（需预处理去除保存液中的硫酸胺：将200ml甘油酸-3-磷酸激酶和60ml甘油醛-3-磷酸脱氢酶，置于含2mmol/L 谷胱甘肽和 0.1mmol/L辅酶I 的0.01mol/L，pH8.0 Tris-HC缓冲液中，透析过夜，更换透析液3次）

【操作方法】

（1）在反应管中加入适量反应液、酶液和H₃ ³² PO₄ 溶液（370MBq），总体积约2ml，混匀后，置37℃温育30min；

（2）将反应液过DEAE-Sephadex A-25柱(DEAE-Sephadex A-25为阴离子交换柱分离纯化产品，〔γ-³² P〕-ATP的回收率可达90%，洗脱液较温和，pH适中，对产品无损伤)。柱先用0.15mol/L NH₄ HCO₃ 淋洗，然后用0.5mol/L NH₄ HCO₃ 淋洗脱，流速1ml/min，分瓶收集洗脱液7-8m1，每瓶1ml；

（3）在洗脱液中，加入一定量的三乙胺和95%乙醇溶液，真空低温冷冻干燥，后，再加入95%乙醇两次，将NH₄ HCO₃ 去除；

（4）取少量乙醇水溶液溶解，用活度计上测定比活度；

（5）再用乙醇水溶液溶解成37MBq/ml，分装冷冻保存。

【质量鉴定】

与上述Ch-T方法相同。