α-标记核苷酸进行热循环测序反应

1.  对应于毎个待测模板，分别以A、G、C、T 标记好4个微量离心管。

2.  分别往标好A、G、C、T 的管子中，加A、G、C、T 测序混合液各3 μl。

 

3.  对于单链模板：在0.5 ml 微量离心管中混匀下列试剂

（1）0.04 pmol 单链DNA模板

（2）0.6 pmol 引物

（3）1.5 μl 10×Vent_R（exo^-）测序缓冲液

（4）1 μl 3%Triton X-100

（5）加水至12 μl

（6）用吸管上下抽吸轻轻混匀溶液。

4.  对于双链DNA模板： 在0.5 ml 微量离心管中混匀下列试剂

（1）0.1 pmol 双链DNA模板

（2）1.2 pmol 引物

（3）1.5 μl 10×Vent_R（exo^-）测序缓冲液

（4）1 μl 3%Triton X-100

（5）加水至12 μl

（6）通过用吸管上下抽吸，使溶液混匀。

5.  毎个模板/引物混合物加1~2 μl 10 mCi/ml［α-³⁵S］dNATP、［α-³²P］dNATP或［α-³²P］dNATP，用吸管轻轻上下抽吸混合溶液。

6.  经步骤5操作后的管子，加入1 μl 2 000 U/ml 的Vent_R（exo^-）DNA聚合酶。