透化细胞和退化细胞器中测定比活性实验

1.从标记细胞提取ATP 1) 备下列材料： 本实验用到的所有溶液必须用Mlli - Q纯化的水或它的等价物配制。 冰冷的4%高氣酺（v/v) 三-n-辛胺 1,1,2-三氮三m乙烷 32p标记的细胞 带螺帽的聚丙烯离心管 测量范围PH4~8的PH试纸 小心：高氣酸■ 三-n -辛胺； U 1，2-三氯三氟乙烧；放射性物质（见附录5)2) 从标记细胞中吸出培养基，用PBS清洗两次

Sigma公司提供了 -种测定MP浓度的非常简单，灵敏&又方便的方法。其原理是用荧光素酶从荧光素和ATP中产生光。在荧光素/荣光素酶浓度恒定的情况下，可以绘制一条不同ATP浓度时产光量变化的标准曲线，因此可以很容易地对来自细胞裂解物的未知样品进行定量。然而，如果要测定的是ATP的7-磷酸的比活性（对于[32P] Pi标记的细胞），需按下述方法进行进一步的实验

1)准备下列材料： Whatman Partisphere SAX高效液相层析柱和保护柱线性梯度洗脱液设定在254nm的紫外线监测仪 装配好的0.2;mi Whatman滤膜和滤器 0.2^?过滤的Milli-Q水 0.2/im S@_0,:5m〇l/LNH4H2ro4 (pH4.2).H3P〇4 分步收集器 ^ Whatman 〇.2; ■ 242 . 待分析的样品 液闪计数器

准备下列材料： 含有未知浓度mp] ATP的细胞裂解物样品 10mg/ml激酶底物肽渐夜（Calbiochem) 0.5mraol/L cAMP 溶液 I、Calbiochem) cA-PrK (Calbiochem) cA-PrK分析缓冲液 lmol/L DTT储存液（^ 2〇尤保存） 0.5mol/LMg〇2 75mmol/L 正磷酸 Whatman P81确酸纤维素滤纸