细胞裂解做western blot的相关问题

DXY网友mavisw提问：我用六孔板做细胞转染，转后要做western blot检测，今天裂解转染后的细胞时直接往六孔板的每个孔中加入了400微升的细胞裂解液，收集离心后未见沉淀，不知道用裂解产物做western blot蛋白含量够不够？

DXY网友Pureflat回复：六孔板中加入400微升裂解液太多，这样会使你得到的蛋白浓度过低，满足不了Western blot上样的需要，我第一次做这个实验时，就犯过相同的错误，因为Western blot对一般蛋白的检测均需要上样40 微克，而上样的体积又是有限的，所以提蛋白时应尽可能的使蛋白浓度高。因此，我通常采用的方法是：先弃去培养液，用冰PBS洗3次，然后用细胞刮将细胞刮入1.5 ml EP管中，低速离心，去上清。若是六孔板的一孔细胞，在沉淀中加入80 微升裂解液即可，然后充分吹打，置于冰上裂解15 min，离心。但是，我觉得有无离心沉淀跟你加入的裂解液体积无关，离心需用12000 rpm × 5 min，不知你的转速达到没有，先测测蛋白浓度再说吧。如果你的样品比较珍贵，可以考虑用Mini型蛋白浓缩柱进行浓缩，我以前见过的最小Mini柱的规格是5 ml的，对你不适用，但是现在有1 ml的Mini柱。

DXY网友juventus2004回复：六孔板最多加200微升裂解液，可以用细胞刮，先低速后高速，高速我采用4度12000转15 min，其实在整个过程中温度很重要，我习惯把所有物品提前置冰块中，在放入4度冰箱，然后拿出实验，而且我在取细胞也在冰上，配裂解液临用临配，而且在冰上配，将EP管置于冰中，裂解我也是把离心管置冰中，然后塞入4度冰箱，15 min。

DXY网友xulees提问：可否告知你们用的细胞裂解液的配方？我想用它们裂解细胞后测一下酶（酸性磷酸酶）的活性，不知道这有影响吗？

DXY网友Pureflat回复：我裂解蛋白是用来做western的，那么裂解液里面就需要加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂，而你测的刚好是碱性磷酸酶，因此不能使用一般的western细胞裂解液。我的western细胞裂解液配方如下。你删去其中的蛋白酶和磷酸酶抑制剂就可以用了。
20 mmol/L Tris-HCl pH 7.4
150 mmol/L NaCl
1% Triton x-100
0.1% SDS
1%脱氧胆酸钠
1 mmol/L EDTA （蛋白酶抑制剂）
1 mmol/L PMSF（蛋白酶抑制剂）
1 μg/ml aprotinin（蛋白酶抑制剂）
1 mmol/L Na3VO4 （磷酸酶抑制剂）
另外，如果你们实验室有超声破碎仪的话，我还有一种更简单的建议方法，我测细胞中的葡萄糖醛酸转移酶是这样破碎细胞的：弃去旧的培养液后，用冰PBS洗3次，然后用Ep管低速离心，去掉大部分上清，重悬细胞，然后超声（将超声转头伸入细胞悬液中）1 min ×2 次，2次之间间隔30 s，这个操作最重要的就是低温，因为超声时产热量大，需将Ep管插在冰上进行超声，间隔30 s也是这个原因。

DXY网友xulees提问：蒙Pureflat战友指点，实在非常感谢！它们对我都是非常有用的资料！我还有几个个小问题：Pureflat 你在测细胞的葡萄糖醛酸转移酶时，是不是先把细胞养至贴壁再测？还是从组织块得到分散的细胞而测定？你用PBS洗时的离心转速是多少？

DXY网友Pureflat回复：我养的细胞本身就是贴壁细胞，所以是在其中加入药物后，用细胞刮刮下来的。如果你需要测组织中酶的活性就更简单了，可以直接用匀浆器对组织匀浆，测定蛋白含量，然后加入酶的底物。细胞用PBS洗涤时用的是1000 rpm x 5 min。