阳阳0602
麻烦请教一下,有人做过小鼠原代神经元活细胞成像观察前的饥饿(或其他方法)诱导自噬吗?我们提取的C57胎鼠原代神经元种植后,正常培养在Neurobasal培养基内(Neurobasal+B27+GlutMAX+双抗),转染了GFP-LC3和目标蛋白A质粒48h后,准备在活细胞工作站中观察A对神经元轴突中自噬体(GFP-LC3)的运动情况。查阅文献大多是在活细胞观察前3h左右进行饥饿处理来诱导自噬,但是这个饥饿的方法并不明确。我们自己做了几次尝试,观察前将Neurobasal培养基全部换成了EBSS,甚至加入了自噬诱导剂,但是最终还是没有观察到神经元中GFP-LC3的移动,不论是轴突、树突、胞体都没有观察到。现在就困惑于此,不知道是转染后时间问题,还是活细胞观察前的诱导问题,亦或者还有其他没有注意到的问题。如果有大神做过类似的实验,还望能够不吝赐教,万分感谢。
橙汁儿青柠味
细胞转染后观察gfp-lc3,此时细胞分成两组,一组对照,另外一组饥饿诱导或者药物诱导,然后两组对比自噬情况。雷帕霉素药物诱导的效果会比饥饿诱导的效果好,建议先试一下
loveliufudan
首先,关于小鼠原代神经元的自噬诱导方法,常用的方法包括饥饿、处理自噬诱导剂和添加氨基酸缺乏介质等。其中,EBSS是一种经常用来模拟饥饿状态的介质。除了EBSS,还可以使用其他的饥饿介质,例如HBSS和Krebs缓冲液等。
在您的实验中,您已经尝试了将Neurobasal培养基全部换成EBSS并加入自噬诱导剂,但是未能观察到GFP-LC3的移动。可能的原因有很多,下面我列举一些可能会影响实验结果的因素:
转染后的时间。转染GFP-LC3和目标蛋白A质粒48小时后,可能需要更长的时间才能观察到自噬体的形成。因此,建议您在转染后不同的时间点进行观察,例如24小时、72小时等。
自噬诱导剂的浓度。自噬诱导剂的浓度会影响自噬体的形成和自噬通路的激活。您可以尝试调整自噬诱导剂的浓度,找到最适合您的实验条件的浓度。
神经元的健康状况。神经元的健康状况可能会影响自噬体的形成。如果神经元受到了不良因素的影响,例如氧化应激和细胞凋亡等,可能会影响自噬体的形成和自噬通路的激活。因此,在实验中,建议您使用健康的神经元。
实验温度。温度对神经元的生长和自噬通路的激活也有影响。您可以尝试调整实验的温度,找到最适合您的实验条件的温度。
土井挞克树
饥饿诱导自噬是目前成功比较高的方法,饥饿可以通过DNA损伤感受器Mec1调控能量匮乏诱导自噬,你可以延长饥饿时间,饥饿时间不足可能是自噬失败的原因
balalaLy
一般细胞饥饿处理4h可以诱导自噬,可以试一下延长饥饿的时间