小鼠原代神经元活细胞成像观察自噬体运动
阳阳0602
麻烦请教一下，有人做过小鼠原代神经元活细胞成像观察前的饥饿（或其他方法）诱导自噬吗？我们提取的C57胎鼠原代神经元种植后，正常培养在Neurobasal培养基内（Neurobasal+B27+GlutMAX+双抗），转染了GFP-LC3和目标蛋白A质粒48h后，准备在活细胞工作站中观察A对神经元轴突中自噬体（GFP-LC3）的运动情况。查阅文献大多是在活细胞观察前3h左右进行饥饿处理来诱导自噬，但是这个饥饿的方法并不明确。我们自己做了几次尝试，观察前将Neurobasal培养基全部换成了EBSS，甚至加入了自噬诱导剂，但是最终还是没有观察到神经元中GFP-LC3的移动，不论是轴突、树突、胞体都没有观察到。现在就困惑于此，不知道是转染后时间问题，还是活细胞观察前的诱导问题，亦或者还有其他没有注意到的问题。如果有大神做过类似的实验，还望能够不吝赐教，万分感谢。
4 个回答
橙汁儿青柠味
细胞转染后观察gfp-lc3，此时细胞分成两组，一组对照，另外一组饥饿诱导或者药物诱导，然后两组对比自噬情况。雷帕霉素药物诱导的效果会比饥饿诱导的效果好，建议先试一下
loveliufudan
首先，关于小鼠原代神经元的自噬诱导方法，常用的方法包括饥饿、处理自噬诱导剂和添加氨基酸缺乏介质等。其中，EBSS是一种经常用来模拟饥饿状态的介质。除了EBSS，还可以使用其他的饥饿介质，例如HBSS和Krebs缓冲液等。
在您的实验中，您已经尝试了将Neurobasal培养基全部换成EBSS并加入自噬诱导剂，但是未能观察到GFP-LC3的移动。可能的原因有很多，下面我列举一些可能会影响实验结果的因素：
转染后的时间。转染GFP-LC3和目标蛋白A质粒48小时后，可能需要更长的时间才能观察到自噬体的形成。因此，建议您在转染后不同的时间点进行观察，例如24小时、72小时等。
自噬诱导剂的浓度。自噬诱导剂的浓度会影响自噬体的形成和自噬通路的激活。您可以尝试调整自噬诱导剂的浓度，找到最适合您的实验条件的浓度。
神经元的健康状况。神经元的健康状况可能会影响自噬体的形成。如果神经元受到了不良因素的影响，例如氧化应激和细胞凋亡等，可能会影响自噬体的形成和自噬通路的激活。因此，在实验中，建议您使用健康的神经元。
实验温度。温度对神经元的生长和自噬通路的激活也有影响。您可以尝试调整实验的温度，找到最适合您的实验条件的温度。
毛利小五郎的徒弟
饥饿诱导自噬是目前成功比较高的方法，饥饿可以通过DNA损伤感受器Mec1调控能量匮乏诱导自噬，你可以延长饥饿时间，饥饿时间不足可能是自噬失败的原因
balalaLy
一般细胞饥饿处理4h可以诱导自噬，可以试一下延长饥饿的时间
