想构建某疾病的角膜上皮细胞模型，本打算用该病病人的血清培养角膜上皮细胞，可想到角膜是无血液的组织，那这种方法还可行吗？

培养方法:

原代培养

1. 将供体角膜放于消毒过的物品上，上皮面朝上，用手术刀切成 12 个三角形组织片。应一刀切下去，避免锯割。如此仔细处理角膜可减少对胶原蛋白基质的破坏和成纤维细胞的脱落。

2. 将角膜组组织片的上皮面翻向下，放入用鼠尾 I 型胶原蛋白预涂的 6 孔培养板，每孔放 4 个组织块。

3. 用镊子轻压组织片，以便使组织块与培养皿表面充分接触。将组织片放置 20 min，使其变干。

4. 将一滴 KGM 轻轻滴于组织片上，在 37°C 和 5%CO2 条件下孵育过夜。尽管从眼库得到的供体角膜是用含有抗菌素的培养液（McCarey-Kauffman 或 Dexsol) 保存的，但全部操作应在无菌条件下进行。

5. 第 2 天，在培养皿中加人 lml 培养液。在培养早期，可观察到细胞仅从角膜缘处迁出，但没有细胞从角膜中央部或巩膜迁出。无血清培养液含有低浓度钙（0.15 mmol/L)，减少胶原蛋白基质降解，故这种培养液可减少成纤维细胞长出。

6 在植入角膜组织片后第 5 天，用镊子将组织片取出，再加人 3 ml 培养液。取出组织片后，贴壁细胞继续增殖。培养后第 2 周，细胞生长形成单层，呈现上皮具有的典型卵石状排列特征。每个角膜约获得 1X106〜5X106 个上皮细胞。

扩增培养

7. 取出组织片后，每周换液 2 次。

8 当细胞汇合达 70%〜80% 时，用 D-PBSA 浸洗细胞。然后，在 37°C 条件下用胰蛋白酶和 EDTA 混合液处理 4 min。

9. 用含有 10% FBS 的 D-PBSA 终止消化。

10 将细胞离心后，用 KGM 混悬。计数细胞，以 1X104 个/cm2 密度将细胞接种于涂有 FNC 的培养皿。

11 在 37°C、95% 空气和 5%CO2 条件下培养。

12. 胰蛋白酶处理和种植 1d 后换培养液。

传代后不久，上皮细胞呈长梭形，折光，迁移能力较强。传代后第 1 周，细胞汇合达 70%〜80% 时呈卵石状排列。如果形成单层后继续培养，细胞能生长成散在的复层结构。

尽管角膜上皮细胞能传至 5 代，约倍增 9〜10 倍，但大多数细胞增殖发生在第 1〜3 代。每个角膜约获得 1X106〜2X106 个上皮细胞。细胞常在第 5 代开始衰老。

角膜是无血液循环的组织，但是角膜表面上皮细胞可以通过泪液提供的养分和氧气进行代谢。因此，使用病人的血清培养角膜上皮细胞可能并不是一个理想的方法。

建议可以使用其他无血清培养基替代血清培养基，如K-SFM（keratinocyte serum-free medium）等，该培养基已经被广泛应用于角膜上皮细胞的无血清培养。此外，也可以使用其他血清替代品来替代血清，如表皮生长因子（EGF）、角膜上皮细胞生长因子（KGF）等，这些因子可以提供角膜上皮细胞所需的生长和分化所需的养分。

可以后续添加血清的，可以先培养看看