PriCells: 正常人角膜上皮细胞和干细胞的分离

实验材料：

1. 完整的人角膜；

2. GMF-Saline G；

3. 中性蛋白酶Ⅱ，1.2U/ml（用DMEM/F12/GASP稀释2.4U中性蛋白酶Ⅱ）；

4. 胰蛋白酶/EDTA；

5. DMEM/F12/GASP；

6. DEME/F12/2FB/GASP：DMEM/F12/GASP含2%FBS；

7. CMF/GASP；

8. LSC培养基；

9. 弯虹膜剪，11cm（4-3/8in）；

10. Jeweler’s镊，10cm（4in）；

11. 角膜剪，19mm刃，尖头；

12. Colibri缝纫钳，0.1mm；

实验方法：

1. 清洗角膜3×5min；

2. 剪除残留的巩膜，结膜和虹膜；

3. 加入2ml中性蛋白酶Ⅱ，4℃过夜，轻微搅动；

4. 将加入中性蛋白酶Ⅱ的角膜放入4℃摇床摇30min；

5. 用DMEM/F12/GASP清洗角膜；

6. 解剖显微镜下，小心去除角膜中央的上皮细胞（此时多数的中央上皮细胞已经剥脱）并除去角膜缘包含有Vogt栅栏区的色素上皮细胞；

7. 用胰蛋白酶/EDTA消化角膜缘上皮细胞片37℃，10min；

8. 加入等体积DMEM/F12/2FB/GASP；

9. 400g离心10min，弃上清；

10. 用DMEM/F12/2FB/GASP洗一遍，离心，弃上清；

11. 加入LSC培养基，将细胞拍散并用血细胞计数板计数；

12. 将细胞以1×104/cm2的密度接种至铺有3T3饲养层的组织培养皿或准备好的人羊膜上；

13. 每三天更换一次培养基；

14. 当细胞达90%汇合时用胰蛋白酶消化传代