PriCells: 正常人原代角膜间质细胞的分离

实验材料：

1. 完整的人角膜；

2. GMF-Saline G；

3. 中性蛋白酶Ⅱ；PriCellls原代细胞分离试剂盒

4. L型胶原酶，1mg/ml在DMEM/F12/GASP中；

5. GMF-Saline G配制的TrypLE Express或0.25%胰蛋白酶；

6. DMEM/F12/GASP；

7. DEME/F12/2FB/GASP：DMEM/F12/GASP含2%FBS；

8. CMF/GASP；

9. 3.5cm塑料组织培养皿或6孔板；

10. 手术刀或单刃的安全刀片；

11. 细胞滤网，70μm血液尼龙过滤网；

12. 塑料刮片，“Cell Lifter”或“Cell Scraper”；

13. 弯虹膜剪，11cm（4-3/8in）；

14. Jeweler’s镊，10cm（4in）；

15. 角膜剪，19mm刀刃，尖头；

16. Colibri缝纫钳，0.1mm；

17. SDS样本缓冲液，使用终浓度：0.058mol/L Tris，5%丙三醇，1.67% SDS，0.02%溴酚蓝；

18. PriCells原代细胞特制基础培养基；

19. PriCells原代细胞培养特制添加剂；

实验方法：

1. 用GMF-Saline G清洗角膜3×5min；

2. 剪除残留的巩膜，结膜和虹膜；

3. 加入PriCells原代细胞分离试剂盒的试剂，4℃摇床摇动过夜；

4. 将加入试剂的角膜4℃摇30min；

5. 用DMEM/F12/GASP清洗角膜；

6. 解剖显微镜下，小心去除上皮和内皮细胞；

7. 用塑料刮片轻刮基膜的上皮细胞面和内皮细胞面。显微镜下观察，以确保完全去除这些细胞层；

8. 用新鲜培养基清洗角膜基质一次；

9. 用手术刀或安全刀片或精细手术剪将基质剪碎成2mm左右的小块；

10. 用DMEM/F12/2FB/GASP配制的胶原酶37℃消化3h，直至大多数组织消失；

11. 400g离心10min，弃上清；

12. 用DMEM/F12/2FB/GASP重悬细胞，用70μm细胞滤网过滤消化液，并离心；

13. 重复上述清洗步骤2遍，每遍之后细胞计数；

14. 用MJM将分离出的间质细胞重悬并以1×104/cm2的密度接种至塑料组织培养皿；

15. 每三天更换一次PriCells原代细胞特制基础培养基＋PriCells原代细胞培养特制添加剂；

16. 当细胞达90%汇合时用胰蛋白酶消化传代