PriCells: 正常人甲状腺细胞的原代培养方法

实验材料：

1.甲状腺细胞材料来源：人孤立性良性甲状腺腺瘤旁边正常组织、甲状腺功能亢进甲状腺组织或甲状腺肿瘤组织均可作为研究的材料；

2.不含Ca2+和Mg2+的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.2；

3.培养用液：DMEM培养液，含15%—20%小牛血清、0.6mmol/L的HEPES、12.5mmol/L的谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素。用5.6%的NaHCO3溶液调节pH值至7.0左右；

4.消化液：0.25%胰蛋白酶溶液；

5.培养器具：培养瓶或皿、孔径为100μm的不锈钢网筛、眼科剪、镊子等；

培养方法：

1．将所取材料放入加有PBS的无菌容器中，立即送至培养室，时间不超过30min。若不能立即培养，可放在培养液站，置4℃下保存，但时间不炒股4h为宜；

2．在无菌条件下，将组织移至平皿内，用PBS洗涤2—3次。用眼科镊剥离去除被膜及结缔组织，并挤压出其中的血液成分；

3．用眼科剪将组织剪成1mm3大小的匀浆状，移入瓶内。加入比细胞多5—10倍量的消化液，于37℃水浴条件下消化30—60min。每隔5—10min摇动1次；

4．消化完毕，加入冷的PBS终止消化。通过孔径100μm的不锈钢网筛过滤。收集滤液于离心管中，以1500r/min离心10min。吸去上清液，将细胞沉淀再用PBS漂洗2次。离心弃上清液。收集未通过筛网的组织，加消化液置37℃水浴条件下继续消化15—30min，并过筛合并。在漂洗后的细胞沉淀中加入一定量的培养液，用吸管吹打数次，制成细胞悬液；

5．吸取少量细胞悬液，加入台盼蓝染液，在血细胞计数板上计数。活细胞比例应大于90%。用培养液稀释细胞至密度为5×105—10×105个/ml；

6．接种细胞悬液到培养瓶或培养皿中。于37℃、含5%CO2培养箱中培养；

7．次日，吸出培养液以去掉未贴壁的细胞，加入新鲜培养液，以后每隔3—5天换液1次；