PriCells: 正常人表皮黑色素细胞的培养
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PriCells: 正常人表皮黑色素细胞的培养
实验材料:
1. 临床活检获取的正常人皮肤材料或新生儿阴茎包皮;
2. 不含Ca 2+ 和Mg 2+ 的1×PBS,添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素,pH7.2;
3. 黑素细胞培养液和培养基中各种添加剂的配制:包括以下种类:①胰岛素。贮存液为5mg/ml,即将0.5g的胰岛素溶于1ml 0.01mol/L的HCl液中,双蒸水加至100ml,过滤除菌、分装,-70℃下保存6个月后方可使用。使用时,在500ml培养基中加0.5ml胰岛素贮存液,即终浓度为5μg/ml;②表皮生长因子。贮存液浓度为5μg/ml,其配制方法是,取0.1mg的表皮生长因子溶于20ml的无Ca 2+ 和Mg 2+ 的D-Hanks液中,以0.2μm孔径的滤膜过滤除菌,按1ml分装,-70℃下保存备用。使用时,在500ml培养液中加0.5ml表皮生长因子贮存液,即终浓度为5ng/ml;③十四焕酰法佛醋酸酯(TPA)。贮存液浓度为0.25mg/ml,配制时将10mg TPA溶于40ml的100%的酒精中,分装后用Parafilm密封,于-20℃保存备用。使用时,在500ml培养基中加20μl的TPA贮存液,即终浓度为10ng/ml;④黑素细胞培养液:MCDB153培养基,使用时添加2mmol/L CaCl 2 ,以4:1比例(V/V)添加Leibovtz L-15、2%胎牛血清、5μg/ml胰岛素、5ng/ml表皮生长因子和10ng/mlTPA,并加入40μg/ml的牛垂体提取物。4℃下保存备用。
4. 其它培养用液:①皮肤材料保存液。主要用于不能即刻进行细胞分离的皮肤材料的保存。为无Ca 2+ 和Mg 2+ 的D-Hanks液,使用时添加100 IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素、100μg/ml庆大霉素和0.25μg/ml两性霉素B,过滤除菌后备用;②表皮消化液。为0.25%的胰蛋白酶溶液。用2.5%的胰蛋白酶溶液0.5ml加4.5ml的无Ca 2+ 、Mg 2+ 的D-Hanks液;③细胞分散液。主要用于细胞分离消化过程中防止细胞聚集形成团块。用MCDB153培养基配制含1.25U/ml中性蛋白酶、0.1%(V/V)透明质酸酶和10%胎牛血清即成细胞分散液,另添加2mmol/L CaCl 2 。使用时按4:1(V/V)的比例与Leibovtz L-15混合;④胰蛋白酶-Versene液。为5×的贮存液,即将2.5%胰蛋白酶溶液0.5ml加入100ml Versene液中。使用时,用无Ca 2+ 和Mg 2+ 的D-Hanks液将5×的贮存液稀释到终浓度胰蛋白酶为0.05%,Versene为0.02%;⑤细胞冷冻保存液。95%胎牛血清加入5%二甲基亚枫。
用于黑色素细胞培养牛垂体提取物的制备:
1.称取牛垂体腺组织25—30g(可于-70℃低温保存);
2.解冻并用无菌双蒸水漂洗垂体组织;
3.以每克组织加2.38ml冷的0.15mol/L NaCl溶液的比例,在振荡器上振荡分散腺垂体组织,使其成为组织碎片,时间不超过30min,并维持其低温状态。然后将混合液移入2L的溶剂瓶中;
4.在2L溶剂瓶中搅动垂体组织90min;
5. 以12000r/min离心45min;
6. 将上清液收集在透析袋中,用1×PBS液于4℃下进行透析。每天更换透 析液1次,共透析3d;
7. 用0.45μm的低蛋白结合滤膜过滤去除微小细胞碎片,再用0.2μm微孔滤膜过滤除菌。分装成每5ml一个包装单位,于-70℃保存。保存至6个月后才使用。一旦解冻立即加入培养基中使用;
8. 可测定提取物中蛋白质含量,并滴定培养基中最佳提取物用量(大约为40μg/ml);
实验方法:
1. 先将皮肤材料用70%的乙醇浸泡30min,再用D-Hanks液冲洗去掉乙醇。然后切开皮肤,用组织剪剪去脂肪和皮下组织,并用外科手术刀片将处理过的皮肤材料切成2mm×3mm大小的皮片;
2. 将切好的皮肤组织皮片移入离心管中,加入表皮消化液,盖紧,摇匀。于4℃冰箱中孵育18—24h;
3. 弃去表皮分离液,加入D-Hanks液冲洗;
4. 分离表皮(透明层)与真皮(较厚而不透明)。用镊子夹住皮肤的真皮部分,将表皮面黏贴向干燥的培养皿底,轻柔地沿其表面将真皮组织与表皮剥离;
5. 将细胞分散液滴在分离后的表皮皮片上以免使表皮干燥。用细胞分散液将表皮皮片收集到离心管中,于37℃下,旋转摇动孵育2—4h(时间长短取决于细胞的分散程度,而摇动可促使游离细胞不断地从皮片中分离出来);
6. 室温下,用D-Hanks液离心洗涤分散细胞悬液3次(每次2000r/min,5min)。洗涤时弃去可能含有胶质层的上清液;
7. 细胞沉淀后,用黑素细胞生长培养基重新悬浮细胞,并进行细胞计数。按2×105个/cm 2 的细胞密度种植,于37℃、5%CO 2 条件下培养48—72h;
8. 细胞种植48h后,换液去除未贴壁细胞。以后每周更新培养液2次。如果较多成纤维细胞的生长,可用含200μg/ml遗传霉素的黑素细胞培养液处理2—3d,以抑制成纤维细胞的生长;
9. 2周内可获得融合70%的原代培养细胞。将细胞培养物用胰蛋白酶-Versene液在室温下消化1min.,用含10%胎牛血清Leibovtz L-15培养液终止消化并收集细胞悬液。200r/min下离心3min。用黑素细胞培养液重新悬浮细胞,计数。以10 4 个/cm 2 细胞密度种植传代细胞。每周更新培养液2次;
10. PriCells-原代表皮 细胞特制基础培养基 ;
11. PriCells-原代表皮细 胞培养特制添加剂 ;
12. PriCells-原代细胞分离试剂盒 ;
13. PriCells-原代细胞 鉴定 试剂盒 ;