正常人表皮朗格汉斯细胞的培养

实验材料：

1. 多来自外科手术的临床病人或死亡时间不超过24h尸体的胸、腹部皮肤；

2. 不含Ca2+和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.2；

3. 培养用液：

①RPMI1640完全培养液，由RPMI1640培养基添加10%人AB血清、2mol/L谷氨酰胺、50μg/ml庆大霉素和1μg/ml消炎痛；

②D-Hanks平衡盐溶液：无Ca2+ 和Mg2+ ，添加庆大霉素50μg/ml；

③消化液：为胰蛋白酶溶液，终浓度为0.05%。贮存液浓度为0.25%，分装，-20℃下保存；

④台盼蓝染液：浓度为0.16%溶于PBS中，过滤除菌，分装保存（-20℃）；

⑤淋巴细胞分离液（密度为1.077g/cm3）：临用时以双蒸水稀释，1.6ml的双蒸水加3.4ml的淋巴细胞分离液；

⑥人基因重组的GM-CSF：浓度为200U/ml；

4. 培养器具：包括金属手术器械如外科手术刀、组织剪、弯剪及眼科直、弯镊等。此外，还有皮片制备器械如软木板、消毒纱布、分离针头、培养皿、削皮片和刀片等。所有用品均消毒后备用；

表皮细胞悬液的制备：

1．用外科手术刀将皮下脂肪除去，并将皮肤切成一定大小的皮片（不超过100cm2 ）。浸入20ml的D-Hanks平衡盐溶液中30min；

2．在软木板上覆盖消毒纱布，并用大头针将皮片固定其上。注意将皮片绷紧十分有利于皮片的制备；

3．抹干皮肤上液体，用备皮刀片取皮片。皮片厚大约0.15mm左右，由表皮和乳头层组成，可根据需要调节片皮的刀片角度以制备出合格的皮片；

4．将皮片的真皮层朝下放入预冷的胰蛋白酶溶液中，于37℃下作用1h，或在4℃下过夜；

5. 向上述被消化的皮片中加入10ml含10%胎牛血清的D-Hanks平衡盐溶液，终止胰蛋白酶溶液的消化作用；

6. 取出一个皮片，用注射用针头或眼科用剪子细将表皮与真皮剥离。如表皮与真皮较易分离，说明胰蛋白酶作用时间长短适宜

7. 将表皮移入另一培养皿，加入少许胎牛血清，用弯剪将皮片剪碎，并用吸管不断吹打；

8. 用消毒纱布过滤悬液，去除残余团块、碎片和角化层；

9. 以含10%胎牛血清的D-Hanks平衡盐溶液离心洗涤过滤液（1000r/min,10min）；

朗格汉斯细胞的富集：

1. 首先将细胞密度调节至5×106 个/cm2 ；

2. 以2:1的比例在15ml离心管中分别加入细胞悬液与淋巴细胞分离液，以1500r/min离心20min；

3. 收集分界面上低密度组分，加入另一15ml离心管中。再用含10%胎牛血清的D-Hanks平衡盐溶液离心洗涤2次（各1000r/min，5min）；

4. 细胞计数，并在相差显微镜下估计朗格汉斯细胞的数量百分比。朗格汉斯细胞数量百分比低，可重复上述步骤，对朗格汉斯细胞进一步富集；

朗格汉斯细胞的短期培养：

1． 将经过上述富集过程的朗格汉斯细胞以5×105个/ml的细胞密度或部分富集表皮细胞以106 个/ml密度种植，加入ROMI1640培养液（添加GM-CSF 200U/ml）；

2． 细胞培养24h后，收集未贴壁细胞，贴壁基本上全部为朗格汉斯细胞；

3． 可重复上述朗格汉斯细胞富集过程，以去除死细胞和残余的角质形成细胞；

4． 继续培养48—72h；