正常人包皮成纤维细胞的培养

实验材料：

1. 细胞来源：新生儿包皮；

2. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.2；

3. 0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液：两者比例为1：1，用D-Hanks液配制；

4. 0.02%大豆胰蛋白酶抑制剂：用DMEM培养液配制；

5. 生长基质：人纤维连接蛋白，按10μg/cm2 包被培养皿；

6. DMEM培养液：DMEM培养基，加10%胎牛血清、青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml；

7. DMF培养液：为无血清化学限定性培养液。基础培养基为1：1的DMEM和Ham F12混合培养基，加入EGF100ng/ml、胰岛素100 ng/ml、转帖蛋白μg/ml、凝血酶1μg/ml、抗坏血酸10μg/ml、氢化可的松5×10-5mol/ml、卵清蛋白1mg/ml和微量元素。添加青霉素100 IU/ml、链霉素100μg/ml；

8. 无菌消毒手术器械、35mm培养皿、三角瓶、100目网筛；

9. 离心管（15ml、50ml）

实验方法：

1. 分离表皮和真皮；

① 在无菌条件下取新生儿包皮，用生理盐水洗净皮片上的血迹；

② 将皮片放入盛有0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液的三角瓶中，密封后存放于4℃冰箱中18h；

③ 转移皮片至培养皿中，小心分离表皮层并弃之；

④ 用DMEM清洗真皮片，备用；

2. 制备细胞悬液；

① 充分剪碎真皮片，加入胶原酶溶液，于37℃孵育1h；

② 用吸管反复吹打组织块，分散细胞；

③ 经100目筛网过滤消化液，收集滤过的细胞悬液；

④ 离心细胞悬液（800r/min，5min），弃上清液；

⑤ 用DMEM培养液将沉淀的细胞团制成细胞悬液；

⑥ 细胞计数，调整细胞密度；

3. 有血清培养：原代细胞和传代后的1—3代细胞用10%胎牛血清的DMEM培养液维持培养；

① 以5×10-5 个/ml的密度将细胞接种于培养瓶中。于37℃、5%CO2 培养箱内培养。每2—3d换液一次；

② 原代培养至成纤维细胞汇合成单层后，按常规方法传代；

4. 无血清培养：用DMF培养液支持已建立细胞系的包皮成纤维细胞的生长和增长；

① 取在含血清条件下已生长汇合成片的培养物，弃培养液。用PBS清洗3次，尽量除去残留血清；

② 用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA溶液消化分散细胞。在镜下观察到细胞变圆后，加入大豆胰蛋白酶抑制剂终止消化；

③ 加入DMF培养液，用吸管吹打分散细胞。调整细胞密度；

④ 取已包被人纤维连接蛋白的35mm培养皿，每皿接种5×104 个细胞。于37℃、5%CO2 的培养箱内培养。每2—3d换液一次；

⑤ 细胞长满基质表面后，按常规方法传代