心肌成纤维细胞的培养

丁香园网友卡列宁的微笑的观点：

用Langendorff灌流消化（胶原酶II）只能取得心肌细胞。建议直接将心脏剪碎，成纤维细胞我们这里一般采用0.05％胰酶消化。无菌条件取出心脏D-hank's液（PBS也可）漂洗，剪碎心脏加入5倍体积消化液，37C水浴3－5min，反复吹打，静置，待自然沉降后弃去上清液。剩余沉淀再加入约5倍体积0.08%胰蛋白酶及0.1%胶原酶II混合液，反复吹打，大约10分钟（消化时间往往靠经验的判断），离心取沉淀重悬于含20％BSA的DMEM（有条件可以用Cascade的培养液）。60－90min后更换培养液（差速贴壁，成纤维细胞比心肌细胞贴壁快）。

1、胰酶的作用比较强烈，联合使用胶原酶将胶原纤维充分消化后利于离心时细胞沉淀，提高细胞存活率。另外，消化时间不宜太长，主要凭观察和经验来判断。离心采用1000rpm 5min。

2、酶的配置可以用d-Hank's液或生理盐水都行。血清的作用主要是终止消化，用一般加了血清的DMEM就行，我们这里是20％胎牛血清。

3、贴壁时间：我师兄曾经告诉我2hr，现在我觉得90min已经很好了。

4、细胞可以先用台盼蓝测定存活率。

5、鉴定：在倒置显微镜下观察，细胞呈梭形、多角形，细胞质透明，细胞核大，呈椭圆形，常含有2－3 个核。IHC可以用I抗体（动物抗人B3、抗波形蛋白、抗血管平滑肌肌动蛋白）其余基本按IHC的步骤来。

丁香园网友googles的观点：

1、用0.05或0.08%的胰酶消化成年大鼠心脏, 效果欠佳, 我是用0.25%的浓度, 分次消化, 6-7次后心脏才能消化完全.

2、由于胶原酶昂贵,我采取的办法是胰酶数次消化得到的细胞及细胞团块综合后,用0.1%的胶原酶消化2次,如此可大大提高细胞得率, 弥补胰酶消化细胞得率低的缺陷.

3、CF应该用2-4代做试验. 由于大鼠细胞只有8代左右的寿命.且5代后细胞的表形将改变, 其增殖能力也显著下降. 因此建议用2-3代的细胞.

4、CF的免疫组画鉴定如果降低标准是比较简单的, 正轨的鉴定很复杂.我是鉴定3个, Vimentin(+)表示细胞来源于间充质, Ⅷ因子(-)表示细胞为非血管内皮细胞. α-actin(-)可排除心肌细胞. 总的说来CF是通过排除法来鉴定的.