正常人胚肺成纤维细胞的培养

实验材料：

1. 肺组织：取自妊娠14—18周的胎儿；

2. 不含Ca2+ 和Mg2+ 的1×PBS，添加200000IU/L青霉素、200mg/L链霉素，pH7.2；

3. 消化液：0.25%胰蛋白酶（pH7.6—7.8），0.02%EDTA溶液；

4. 培养液：DMEM或RPMI1640，加10%—20%胎牛血清、青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml；

5. 保存液：10%二甲亚砜或10%甘油；

6. 眼科剪、眼科镊等无菌消毒手术器械；

7. 离心管（15ml、50ml）

实验方法：

1. 取水囊引产的妊娠3—6个月的胎儿。用75%乙醇消毒胸壁。剖胸取出两肺。剪去肺内较大的支气管后，将肺边缘组织置于平皿中，用PBS液清洗3次，除去血液。选择苍白色的肺组织，剪成1mm3 左右的碎块。再用PBS液洗2—3次，直至液体澄清为止；

2. 将肺组织块移入三角瓶中，加入5—6倍量的0.25%胰蛋白酶，密封瓶口。置4℃冰箱内消化20h；

3. 吸弃上层液体。往三角瓶中加入少量培养液，用吸管反复吹打分散细胞。稍静置，待残存的组织块下沉后，吸出细胞悬液；

4. 计数细胞，并用培养液调节细胞密度；

5. 将细胞以3×106 个/ml的密度接种于培养瓶中，于37℃、5%CO2 培养箱中培养。24h后换液，除去未贴壁的细胞及细胞碎片。以后每隔2—3d换液一次；

6. 待细胞汇合成片后，用0.25%胰蛋白酶与0.02%EDTA（1：1，V/V）混合消化液消化细胞，进行继代培养；

7. 如果要冻存细胞，以便长期使用，可以将成片细胞经消化分散后，悬浮于保存液中，调节细胞密度至1.5×106 —2.0×106 个/ml。每管1—2ml分装入冻存管，置于液氮罐中保存。