原理
胰蛋白酶消化后，用 EDTA 分散从皮肤片分离的表皮片，然后用添加 bFGF（FGF-2）的无血清培养液培养。
材料与仪器
D-PBSA 胎牛血清 大豆胰蛋白酶抑制剂
添加激素的黑素细胞培养液 胰蛋白酶和EDTA混合液
组织培养皿 吸管 离心管湿润的培养箱 水浴箱 电子细胞计数仪或血细胞计数板
添加激素的黑素细胞培养液 胰蛋白酶和EDTA混合液
组织培养皿 吸管 离心管湿润的培养箱 水浴箱 电子细胞计数仪或血细胞计数板
步骤
原代培养
第 1 天
1. 用 70 % 乙醇浸洗皮肤标本，然后用 D-PBSA 浸洗 2 次。
2. 将组织移入无菌 100 mm 培养皿，表皮面朝下。
3. 用解剖剪除去皮下脂肪和深部真皮。
4. 将剩余的组织用手术刀切成 2 mm × 2 mm 小块。刀片在组织上摇动，但不要采用锯切。
5. 将组织块移入盛有冷的 0.25 % 胰蛋内酶的 15ml 离心管。
6. 在室温条件下，将组织块孵育 60~90 min 。对于某些供体的皮肤，先在 4°C 条件下孵育 18~24 h，然后在 37°C 条件下孵育 1~2 h，这样可获得较多的黑素细胞。
第 2 天
7. 轻拍离心管，使沉于底部的组织块移动。然后，将离心管内的内容物快速倒入 60 mm 培养皿。
8. 用手术镊将组织块逐一地移入 100 mm 干培养皿，上皮面朝下。轻轻摇动组织块，使其接触培养皿底壁。应使表皮层附着在培养皿上，以便用手术镊彻底分离真皮。除去真皮片。
9. 将表皮片移入盛有 5 ml 0.02% EDTA （0.7 mmol/L）的 15 ml 离心管。注意将表皮片放入 EDTA 液，不要贴在离心管壁上。
10. 轻轻摇晃离心管，使表皮片分散成单细胞。
11. 离心（350 g，5 min），然后吸去上清液。
12. 用 MHSM 混悬细胞。
13. 用血细胞计数板计数细胞，然后在 35 mm 培养皿用 2 ml 含有 5 % FBS 的 MHSM 孵育细胞，细胞密度为1×106 个（约2×104~4×104 个黑素细胞）。FBS 促进细胞贴壁。
14. 用含有生长因子和牛垂体提取物的 MHSM 换液，每周 2 次。
第 3~30 天
15. 培养 24 h 后，培养的细胞中含有原代角质形成细胞和散在的黑素细胞。角质形成细胞在几天后停止增殖，角质形成细胞克隆在第 2 周浮起。第 2 周末，只剩有黑素细胞。在大多数情况下，细胞在 2~4 周内生长接近汇合，此时准备传代。
传代培养
16. 用 0.02% EDTA（0.7 mmol/L）轻轻浸洗细胞 2 次。
17. 加入 3 ml 0.25 % 胰蛋白酶和 0.1 % EDTA（2.5 mmol/L）混合液，在 37°C条件下孵育。每 5 min 在相差显微镜下观察 1 次，检査细胞的去附着情况。
18. 当大多数细胞去附着时，用 10 μg/ml 大豆胰蛋白酶抑制剂或 1 ml 含有小牛血清的培养液使胰蛋白酶失活。传代时，“血淸刺激”有益于在无血清条件下维持黑索细胞生长。
19. 吹打培养皿中的细胞，保证全部黑素细胞去附着。
20. 吸出细胞悬液，离心（350 g，5 min )。
21. 吸去上淸液，用含有 5 % FBS 的无钙黑索细胞培养液混悬细胞。每个 100 mm 培养皿内放入 2×104~ 4×104 个细胞。黑素细胞很好地贴于塑料培养皿（> 75 % ) 要 FBS。但是，如果培养皿涂有纤连蛋白或 Ⅰ 型胶原蛋白和 Ⅲ 型胶原蛋白混合物，可不用 FBS [ Gilchres te al.，1985 ] 。
22. 用无血清或含有血淸的黑素细胞培养液换液，每周 2 次。用含有血清的培养液培养能获得较多的细胞，但含有血淸的培养液促进成纤维细胞的生长。将 Ca2＋ 浓度降至 0.03 mmd/L 不影响黑素细胞的增殖，但抑制成纤维细胞的过度生长 [ Naeyaert et al.，1991 ]。
添加激素的黑素细胞培养液（melanocyte hormone-supplemented medium，MHSM）：
(a)199 培养液（400-1200，GIBCO）：93.1 ml；
(b)EGF（B-D Biosciences）：0.1 ml，储存浓度为 10 μg/ml，最终浓度为 10 ng/ml；
(c)转铁蛋白（Sigma）：0.1 ml，储存浓度为 10 mg/ml，最终浓度为 10 μg/ml；
(d)胰岛素（Sigma）：0.1 ml，储存浓度为10 mg/ml，最终浓度为 10 μg/ml；
(e)三碘甲状腺原氨酸（Sigma）：0.1 ml，储存浓度为 1 μmol/L，最终浓度为 1 nmol/L；
(f)氧化可的松（Calbiochem）：0.5 ml，储存浓度为 0.28 mmol/L，最终浓度为 1.4 μmol/L；
(g)霍乱毒素（Calbiochem）：1.0 ml，储存浓度为 1 μmol/L，最终浓度为 1 nmol/L。可用牛垂体提取物和双丁酸环腺背酸代替霍乱毒素。牛垂体提取物（Clcmetics）的储存浓度为 35 μg/ml，最终浓度为 0.7 ng/ml。双丁酸环腺汗酸（Sigma）的储存浓度为 1 mmol/L，最终浓度为 100 μmol/L；
(h)bFGF（Amgen）：5.0 ml，储存浓度为 200 ng/ml，最终浓度为 10 ng/ml。
第 1 天
1. 用 70 % 乙醇浸洗皮肤标本，然后用 D-PBSA 浸洗 2 次。
2. 将组织移入无菌 100 mm 培养皿，表皮面朝下。
3. 用解剖剪除去皮下脂肪和深部真皮。
4. 将剩余的组织用手术刀切成 2 mm × 2 mm 小块。刀片在组织上摇动，但不要采用锯切。
5. 将组织块移入盛有冷的 0.25 % 胰蛋内酶的 15ml 离心管。
6. 在室温条件下，将组织块孵育 60~90 min 。对于某些供体的皮肤，先在 4°C 条件下孵育 18~24 h，然后在 37°C 条件下孵育 1~2 h，这样可获得较多的黑素细胞。
第 2 天
7. 轻拍离心管，使沉于底部的组织块移动。然后，将离心管内的内容物快速倒入 60 mm 培养皿。
8. 用手术镊将组织块逐一地移入 100 mm 干培养皿，上皮面朝下。轻轻摇动组织块，使其接触培养皿底壁。应使表皮层附着在培养皿上，以便用手术镊彻底分离真皮。除去真皮片。
9. 将表皮片移入盛有 5 ml 0.02% EDTA （0.7 mmol/L）的 15 ml 离心管。注意将表皮片放入 EDTA 液，不要贴在离心管壁上。
10. 轻轻摇晃离心管，使表皮片分散成单细胞。
11. 离心（350 g，5 min），然后吸去上清液。
12. 用 MHSM 混悬细胞。
13. 用血细胞计数板计数细胞，然后在 35 mm 培养皿用 2 ml 含有 5 % FBS 的 MHSM 孵育细胞，细胞密度为1×106 个（约2×104~4×104 个黑素细胞）。FBS 促进细胞贴壁。
14. 用含有生长因子和牛垂体提取物的 MHSM 换液，每周 2 次。
第 3~30 天
15. 培养 24 h 后，培养的细胞中含有原代角质形成细胞和散在的黑素细胞。角质形成细胞在几天后停止增殖，角质形成细胞克隆在第 2 周浮起。第 2 周末，只剩有黑素细胞。在大多数情况下，细胞在 2~4 周内生长接近汇合，此时准备传代。
传代培养
16. 用 0.02% EDTA（0.7 mmol/L）轻轻浸洗细胞 2 次。
17. 加入 3 ml 0.25 % 胰蛋白酶和 0.1 % EDTA（2.5 mmol/L）混合液，在 37°C条件下孵育。每 5 min 在相差显微镜下观察 1 次，检査细胞的去附着情况。
18. 当大多数细胞去附着时，用 10 μg/ml 大豆胰蛋白酶抑制剂或 1 ml 含有小牛血清的培养液使胰蛋白酶失活。传代时，“血淸刺激”有益于在无血清条件下维持黑索细胞生长。
19. 吹打培养皿中的细胞，保证全部黑素细胞去附着。
20. 吸出细胞悬液，离心（350 g，5 min )。
21. 吸去上淸液，用含有 5 % FBS 的无钙黑索细胞培养液混悬细胞。每个 100 mm 培养皿内放入 2×104~ 4×104 个细胞。黑素细胞很好地贴于塑料培养皿（> 75 % ) 要 FBS。但是，如果培养皿涂有纤连蛋白或 Ⅰ 型胶原蛋白和 Ⅲ 型胶原蛋白混合物，可不用 FBS [ Gilchres te al.，1985 ] 。
22. 用无血清或含有血淸的黑素细胞培养液换液，每周 2 次。用含有血清的培养液培养能获得较多的细胞，但含有血淸的培养液促进成纤维细胞的生长。将 Ca2＋ 浓度降至 0.03 mmd/L 不影响黑素细胞的增殖，但抑制成纤维细胞的过度生长 [ Naeyaert et al.，1991 ]。
添加激素的黑素细胞培养液（melanocyte hormone-supplemented medium，MHSM）：
(a)199 培养液（400-1200，GIBCO）：93.1 ml；
(b)EGF（B-D Biosciences）：0.1 ml，储存浓度为 10 μg/ml，最终浓度为 10 ng/ml；
(c)转铁蛋白（Sigma）：0.1 ml，储存浓度为 10 mg/ml，最终浓度为 10 μg/ml；
(d)胰岛素（Sigma）：0.1 ml，储存浓度为10 mg/ml，最终浓度为 10 μg/ml；
(e)三碘甲状腺原氨酸（Sigma）：0.1 ml，储存浓度为 1 μmol/L，最终浓度为 1 nmol/L；
(f)氧化可的松（Calbiochem）：0.5 ml，储存浓度为 0.28 mmol/L，最终浓度为 1.4 μmol/L；
(g)霍乱毒素（Calbiochem）：1.0 ml，储存浓度为 1 μmol/L，最终浓度为 1 nmol/L。可用牛垂体提取物和双丁酸环腺背酸代替霍乱毒素。牛垂体提取物（Clcmetics）的储存浓度为 35 μg/ml，最终浓度为 0.7 ng/ml。双丁酸环腺汗酸（Sigma）的储存浓度为 1 mmol/L，最终浓度为 100 μmol/L；
(h)bFGF（Amgen）：5.0 ml，储存浓度为 200 ng/ml，最终浓度为 10 ng/ml。
来源：丁香实验
