PriCells: 利用Hoechst 33342外流性质分选原代角膜间质干细胞

利用Hoechst 33342外流性质分选原代角膜间质干细胞

试剂和材料：

1. 2—4代的间质细胞；

2. HBSS/2FB；

3. Hoechst 33342染料，1mg/ml水溶；

4. 碘化丙啶（PI），2mg/ml水溶；

5. 维拉帕米，500μg/ml水溶；

6. DEME/2FB；

7. 胰蛋白酶/TrypLE：TrypLE Express或0.25%胰蛋白酶，溶于CMF-Saline G；

8. MoFlo（或与其类似的）高速细胞分选仪，具备350nm激发能力；

实验方法：

1. 用PriCells原代细胞分离试剂盒2—4代的间质细胞；

2. 细胞计数，用DMEM/2FB将细胞稀释至1×106/cm2个细胞/ml；

3. 加入5μg/ml Hoechst 33342染料，37℃，90min，每20min搅动一次；

4. 对照组细胞在加入Hoechst 33342染料前，先加入50μg/ml维拉帕米孵育20min；

5. 染色后，在4℃环境下用HBSS/2FB将细胞洗两遍并离心，之后在冰上用冷HBSS/2FB重悬细胞；

6. 于分选前加入2μg/ml PI以鉴别无活性的细胞；

7. 无菌条件下分选细胞，高速细胞分选仪，用350nm激发。收集蓝色（670nm）和红色（450nm）荧光均减弱的细胞。边群细胞通过上述步骤与死细胞和完全被染料标记的细胞分离开并被收集起来。对照组要确保用维拉帕米先行孵育后使边群细胞消失；